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兔单抗亲和力和灵敏度更高
相对于鼠单抗（解离常数Kd在10-9-10-10M水平），兔单抗的亲和力可提高100-1000倍（Kd在10-10-10-12M水平）。实际使用时，兔单抗的工作浓度更低，灵敏度更高，因此产生的背景更低，大大降低了假阳性的发生。用作免疫组化等用途时，有时甚至可免去抗原修复的步骤。
兔单抗能识别更多表位
很多蛋白在人类和啮齿动物中同源性很高，这些保守表位在小鼠体内免疫原性很弱，不容易产生高质量抗体。而兔做为宿主，可以更好地识别这些表位，产生针对更多表位的抗体。当然，兔也适合生产针对鼠类蛋白的抗体。
深入浅出详解单克隆抗体制备
五、单克隆抗体的大量生产
大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：
1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。
2. 体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
① 实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。但采血量有限。
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细 胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可 获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
六、单克隆抗体的鉴定
对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:
1. 抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制 备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗 体。② 制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。
2. McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔 抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作 双扩试验时，如加入适量的PEG(3％)，将有利于沉淀线的形成。
3. McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
4. McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。
5. McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
七、影响因素、失败原因分析
由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。
其主要失败原因和影响因素有:
1. 污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污 染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支 原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹 水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。
2. 融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。
3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体
① 融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。
② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
③ 对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。
三要:
要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。
要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。
要定期进行再克隆。
三不要:
不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。
不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。
不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。
4. 杂交瘤细胞难以克隆化
可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。
编辑: wangminchao
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