活体动物体内光学成像技术常见问题解答

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发布日期：2012-02-10 09:46 文章来源：Berthold
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关键词： 丁香园 生物专题 伯托生物 活体成像 　 点击次数：

关于细胞标记和荧光素酶的特性

1. 荧光素酶的发光是否需要激发光？ 荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素(Luciferin)。

2. 荧光素酶的发光特性如何？ 荧光素腹腔注射老鼠后约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到稳定的最高点。在最高点持续约20-30 分钟后开始衰减，约三小时后荧光素排除，发光全部消失。最好的检测时间是在注射后15到35分钟之间

3. 底物荧光素(Luciferin)是如何进入小鼠体内的？需要多少？ 荧光素是腹腔注射或尾部静脉注射进入小鼠体内的，约一分钟就可以扩散到小鼠全身。 大部分发表的文章中，荧光素的浓度是150mg/kg (见下图)。20克的小鼠需要3毫克的荧光素，价钱约两到三美元。常用方法是腹腔注射，扩散较慢，开始发光慢，持续发光长。若进行荧光素静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间很短。

4. 荧光素的体内代谢过程 不同品牌的荧光素底物的代谢过程不太一样， 使用前最好做一些体外试验，做一个标准曲线。下面是我们试验的一些例子：

5. 两次观察间隔时间最短为多长时间？ 观察时间的间隔没有最短限制， 只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。

6. 荧光素酶基因，荧光素酶，荧光素底物有多大？可以透过血脑屏障吗？ 荧光素酶有554个氨基酸，约50KD。荧光素酶的底物荧光素，约280道尔顿。荧光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。

7. 做体内实验的luciferin 与体外实验的是不是一样，如何购买？最小包装多大？ 体内生物发光是用的是D-Luciferin，我们提供1g或小到100mg 的包装。

8. 如何保证荧光素酶(Luciferase)的稳定性？ 荧光素酶基因是插到细胞染色体内的，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光酶也会得到持续稳定的表达。荧光素酶的半衰期约三个小时，所以只有活细胞才能够持续表达荧光素酶。

9. 标记的肿瘤接种以后，会发生luciferase的丢失吗？ 没有正式的报道丢失Luciferase的情况。丢失的可能性及量非常小，不会影响实验结果。一些实验报道的结果中，标记的细胞在动物体内存活几年的时间还可以持续发光，说明Luciferase基因的标记非常稳定。

10. 在in vitro 的细胞培养中，为什么要经常用抗生素筛选？ 荧光素酶基因标记的细胞株是经过单克隆筛选培养过的稳定的细胞株。体外培养过程中，不筛选也可以，只要时间不是很长， 接种代数不要很多。到目前为止，还没有发现基因丢失的情况。但若接种的代数过多，建议用药物筛选一段时间或从原始的细胞株培养以保证细胞发光的强度。

11. 可以用肿瘤块而不是细胞接种吗？ 可以先用标记的细胞在皮下接种，然后从皮下取出肿瘤块进行原位接种。

12. 荧光素酶基因在标记的细胞中有多少个COPY，在什么位点？ 细胞中的copy数目，和标记的位点对于实验没有任何影响，后来的实验中基本不进行那样的研究。

13. 标记细胞与标记基因所用的启动子有何不同？ 标记细胞一般用在细胞内能稳定表达的启动子, 显示细胞的数目。标记基因一般用此基因的启动子，与此基因平行表达，显示此基因的表达数目。

14. 荧光素酶的表达高低与所用启动子的活性有关吗？ 有关，启动子的活性高，则荧光素酶的表达高，启动子的活性低，则荧光素酶的表达低。还可以根据此原理，用特定的启动子驱动荧光素酶，来观察该启动子在活体动物体内的特定条件下的表达情况，并检测影响该启动子表达的因素。这正体现了应用活体成像技术研究的优势。

15. 有几种常用的荧光素酶？特性如何？ 常用的有两种荧光素酶，Luciferase 和 Renilla荧光素酶，二者的底物不一样，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine 。二者的发光颜色不一样，前者所发的光波长在540-600nm，后者所发的光波长在460-540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快。大部分的发表文章通常使用前者用作报告基因， 也有一些文章使用两者进行双标记。

16. 组织切片可以观察到生物发光吗？ 可以，但荧光酶的体外活性保持时间比较短， 约几十分钟。有相关的文献。

17. 标记好的细胞的荧光素酶是随机还是插入固定的位点？ 插入的位点是随机的，但每一个构建好的细胞株我们都做过详细的分析，与其母细胞株进行详细的比较，证明荧光素酶的插入对细胞的各种特性(包括生长周期，成瘤性等)没有造成影响。

18. 能标记病毒吗？能标记病毒的某一个基因吗？ 可以标记病毒，由于病毒在核酸结构上的特性，每个病毒标记的方法不一样，具体的可以参见有关文献。还没有看到标记病毒某一个基因的报道， 但理论上讲，将荧光素酶基因与想标记的基因平行表达，可以标记任何基因。

19. 细菌标记问题 对于细菌标记，一般利用发光酶基因操纵子luxABCDE控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。 利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是一般细菌标记需要转座子的帮助把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。已经标记好了几十种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，在这方面很有经验。具体标记情况请与我们直接联系。

关于仪器的特性等问题

20. 为何活体成像技术能看到体内发出的可见光？ 两个主要原因使可见光成像技术能够看到体内发出的微弱的可见光。一是高灵敏度的制冷CCD镜头，可达到零下-90°C，使体内发出的非常少的光子也能够检测到。 二是绝对密封的暗箱装置，可以屏蔽包括宇宙射线在内的所有光线。

21. 正常成体小鼠可以看到体内发光吗？ 是否不需要裸鼠？ 可以。成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在与对可见光的穿透性不同，我们的技术可以看到成体正常老鼠的体内发光。这正是这项技术的价值所在。可见光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作为活体成像的动物， 并有很多关于大鼠的文章。

22. 能检测在组织内部的发光吗？光能透过肌肤多深？ 可以。若有发光足够强的标记细胞，在老鼠体内任何一个地方都能看到约一立方毫米的细胞瘤(约10⁶细胞)。穿透性可达到3-4CM (小鼠身体厚度约7-8 CM)。

23. 仪器灵敏度如何？ 仪器对发光细胞检测的灵敏度与细胞发光的强度有关。在标记细胞活跃发光的情况下， 仪器可以检测到最少100个皮下接种的发光细胞。若细胞在体内位置深(如原位种植)，比如内脏，最少能检测到的细胞数目需要多一些。一般每增加0.5cm可检测到的最少细胞数增加一个数量级。

24. 能检测分散在各处的单个细胞吗? 可以检测到流体的细胞，只要细胞总数达到100以上。许多文章，其中用荧光素酶标记了T细胞，NK细胞，造血干细胞和其他淋巴细胞。在这些标记的细胞总数达到一百以上时，我们的仪器可以观察到信号。

25. 活体成像技术如何定量分析？ 活体可见光成像技术采取绝对光子数的计算方法，记录单位时间内、单位面积、单位角度接受到的光子数。这样，不同时间、不同仪器的测量结果可以进行比较，具有绝对的定量意义。每一个新标记的细胞株都要进行全面的定量分析才能用于定量实验，其中包括在体外和体内固定位置细胞发光的标准曲线。

26. 不同的组织对光的吸收程度不一样，不同的组织之间能进行定量研究吗？ 不能。目前的文献都是同样的组织比较，进行同样组织的前后不同时间的定量分析。

27. 荧光素酶的发光强度是否同细胞的数量成正比？ 是的，荧光素酶的发光强度同标记的靶点, 包括细胞、基因、细菌和病毒的数量成正比。密西根大学Brian Ross发表的一篇文章专门研究了这个问题。确定荧光素酶的发光强度与细胞数成正比关系，并且线性关系到0.9 以上。

28. 仪器的解析度如何？分辨率如何？ 仪器的最高解析度在0.1毫米左右。由于可见光是漫射光，在体内走的路线不是直线，所以该仪器的体内光源的分辨率不是很好，通过该仪器观察的发光图片不能代表发光物质的结构信息，在动物体表所捕捉的发光信号只能代表发光的强度和大概的位置。小动物CT和MRI，在这方面具有优势，因为放射线走的路线很直。

29. 能定位在哪个脏器吗？凭什么？当进行肿瘤转移研究的实验时，在观察期间，不杀死动物，如何判断某一部位发光是由于皮肤、皮下组织，肌肉，脏器还是骨骼的肿瘤转移造成的发光？特别是对于一些较小的脏器，如淋巴结转移。 此技术无法直接定位标记细胞和基因所在的组织和器官。但是实验人员凭经验，可以靠发光细胞在老鼠的身体位置推断标记细胞或基因所在的脏器。若需要证实，还需要将老鼠解剖，进行体外检测。

30. 拍摄普通照片的和生物发光照片的是一个CCD镜头吗? 是，只不过爆光时间和快门不一样。

31. 镜头那么低温度，动物不会冻死吗？ 低温只是在CCD镜头的小环境内。其它范围内都是室温。

32. 使用麻醉机相对于腹腔注射麻醉有什么优点？ 麻醉系统可以对小鼠的麻醉情况包括时间，程度等有更精确的控制。使用起来也会更加方便。

33. 荧光配件相对于其他公司的荧光的优势在哪里？ 相对宽的应用范围，可以观察波长在400-900nm的荧光，因此适用于GFP及各种荧光染料的标记。还有一套12张专门的滤光片用来消除非特异性的背景光。并且其成像速度快，适合大批量的实验。

编辑: cq

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