量子点作为生物荧光标记物的研究进展
为了弄清生物体内各种反应的机理，人们必须对生物体内各种蛋白质或者细胞的相互作用进行监控，过去主要用同位素和有机荧光染料标记细胞和生物分子来达到这一目的。但众所周知同位素和有机染料存在一系列的缺陷从而限制了其在生物活体内的应用。量子点的出现解决了这一问题，并大有希望成为新一代生物荧光标记物。
量子点(Quantum dots，QDs)又称半导体纳米晶体（Semiconductor nanocrystal），是一种由Ⅱ-Ⅵ族(如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等)或Ⅲ-Ⅴ族（如InP、InAs等）元素组成的纳米颗粒，目前研究较多的是CdSe、CdTe等。量子点一般是直径为1-10nm的球状晶体，也有将其制成棒状和四脚锥体状的报道，但球状量子点在生物学中的应用最为广泛。因此本文将着重围绕球状量子点来对量子点的光学特性、制备方法及其作为荧光标记物在生物学中的研究进展作一简要综述。
1、量子点的光学特性
与传统的有机荧光染料或镧系配合物相比，荧光量子点具有以下光学特性：(1) 量子点的发射波长可通过控制它的粒径大小来“调谐”，因而可获得多种可分辨的颜色。以ZnS 包被的CdSe纳米颗粒为例，当CdSe核心直径为1.8nm时，发射蓝光；当CdSe核心直径为7nm时，发射红光，不同尺寸大小的CdSe的荧光可涵盖整个可见光谱。(2) 不同大小的纳米晶体能被同一波长的光激发并发出不同颜色的光，其激发光谱宽且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，因此不同的量子点可以由同一波长的光激发，并允许同时使用不同光谱的量子点来进行生物标记。而不同荧光染料分子需多个激发波长，且激发光谱窄，发射光谱宽，不同颜色荧光分子的光谱容易相互重叠，因而很难同时使用两种以上的荧光分进行多色标记。(3)量子点具有良好的光化学稳定性，可以耐受更强的激发光和更长的光发射周期。染料荧光分子的激发和发射周期一般只有几分钟，而量子点通常可持续几个小时，如ZnS包被的CdS量子点的稳定性是罗丹明6G的100倍。
2、量子点的合成
2.1合成方法
对于做生物荧光探针的量子点来说，目前主要有两种合成方法：一种是在水相中合成，另一种是采用胶体化学的方法在有机相中合成．1993年以前，量子点主要通过在水溶液中加入稳定剂如硫化甘油、聚磷酸盐等制得。近年来也有在水溶液中合成量子点的报道，如Lin 等采用巯基丙酸为稳定剂，通过静电作用直接在水溶液中合成了CdTe半导体纳米粒子。在水溶液中直接合成量子点操作简单，所用材料价格低、毒性小。然而，在水溶液中合成的量子点荧光产率都很低，量子点的尺寸分布范围也较大（相对标准误差RSD>15%）。
科学家经过许多尝试，都没有完全解决水溶液中合成的量子点存在的荧光产率低、尺寸分布广等缺点，因此近年来人们越来越多地采用在有机体系中合成量子点。1993年，Murray等用(CH3)2Cd和TOPSe(Trioctylphospine selenide)作为前体在高温的氧化三辛基磷(TOPO)溶液中合成了CdSe量子点。这种方法能制备出具有良好结构的量子点和较小的尺寸变异系数（RSD<5%），但是其荧光产率仍然很低（大约只有10%）。后来，人们发现在量子点表面包被一层ZnS能显著提高量子点的量子产率。1996年，Hines等合成了ZnS包覆的CdSe量子点，其在室温下的荧光产率显著提高。Dabbousi等在此基础上，将其制备好的单分散的CdSe纳米颗粒表面包覆了一层ZnS，将其量子产率提高到30%-50%。近来，Peng等人对传统的合成方法进行了改进，他们用CdO作为原料，一步合成了高荧光产率的CdS、CdSe、CdTe纳米晶体。相对于传统的核/壳纳米微粒，该方法合成的量子点在不进行表面包被的情况下也具有非常高的量子产率。
2.2 水溶性量子点的制备
采用胶体化学法在有机体系中制备量子点，其疏水表面限制了量子点在生物环境中的应用。难以获得生物相容性的量子点也是目前限制量子点在生物科学中应用的最大问题。因此在与生物分子偶联之前，必须先将其表面用一定的双功能基团修饰，使其具备一定的水溶性同时又能与生物分子偶联。科学家通过不断努力已发展了几种制备水溶性量子点的方法。
Bruchez等首先报道了水溶性量子点的制备，他们直接用3-(巯基丙基)三氧甲基硅烷(MPS)取代氧化三辛基磷(TOPO)保护的（CdSe）ZnS量子点上的TOPO分子，再将三氧甲基硅烷水解，便在量子点的表面形成了一层带有二氧化硅/硅氧烷的壳，然后再将量子点与一些双功能的甲氧基化合物（如氨基丙基三甲氧基硅烷、三甲氧基丙基脲等）反应，便制成了水溶性的量子点。另外一种制备水溶性量子点的方法是直接吸附一些双功能配基，如Chan等将巯基乙酸和一种有机碱加入到TOPO保护的量子点的氯仿溶液中，有机碱将巯基和羧基上质子夺去后，量子点表面的Cd2+和Zn2+可通过静电引力与巯基乙酸相结合，量子点便可以从有机溶剂中沉淀出来，从而获得水溶性量子点。
硅烷化的QDs有很好的稳定性，但是每次只能制得微克量级的量子点，而且在中性pH条件下，量子点表面残留的硅氧基易导致凝胶或沉淀生成。相应地，通过直接吸附巯基乙酸虽然每次可获得数克水溶性量子点，但巯基乙酸不稳定，很容易从量子点表面脱附，从而导致量子点团聚和沉淀。为解决这些矛盾，研究者已另外探索出两种制备方法：一种方法是通过疏水作用和离子相互作用在量子点表面包被一层蛋白质，初步结果表明蛋白质包被的QDs在缓冲液中至少能稳定存放两年，其量子产率也与在氯仿中制得的QDs差不多；另一种方法是先制备内部镂空的高分子小球（micell），然后将量子点装入高分子小球的孔隙中，如Dubertret等将未进行任何表面改性的（CdSe）ZnS量子点直接装入由聚乙二醇（PEG）、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰胆碱（PC）混合组成的磷脂高分子微球的疏水核心，这样制成的量子点微球大小均匀，形状规则，几乎不存在团聚情况。
3、量子点作为生物标记物的应用
由于量子点具有普通荧光物质无法比拟的光学特性，因而将其作为荧光探针用于生物分子的标记和检测，从而在细胞定位、信号转导、胞内组分的运动和迁移以及临床诊断等研究中发挥巨大作用，是其在生物科学中最有前途的应用之一。量子点虽最近几年才引起生物学家极大关注，但其在生物科学中的应用研究已取得了一些突破性的进展。
3.1 细胞标记
细胞标记是目前量子点应用最广泛的研究领域，量子点对活体细胞的标记主要有两种方法：（1）通过受体介导的细胞膜内吞作用将QDs转入到细胞质中从而实现对细胞的标记。Chan等将（CdSe）ZnS通过巯基乙酸与转铁蛋白共价交联，然后在受体介导下通过内吞作用将QDs转运进HeLa细胞中，不仅实现了对细胞的标记，而且还证明连接了量子点的转铁蛋白仍然具有活性。最近，Hoshina等同样通过内吞作用将QDs引入T-淋巴细胞，应用QDs作为荧光探针观察小鼠的淋巴细胞成像，试验结果证明，量子点标记物很稳定并且不影响细胞活动和功能，可以在一周内追踪活体内的淋巴细胞；（2）通过细胞表面蛋白质的特异性结合来标记细胞。Tokumasu等通过偶联了抗体的QDs标记血红细胞膜上的Band3蛋白，观察到Band3蛋白在细胞膜上的分布及血红细胞在受到疟原虫侵袭时细胞膜的变化。此外，Zhelev等2005年合成了lectin通过标记的量子点并从正常淋巴细胞中分离出白血病细胞，其结果优于商业化FITC–lectin。
3.2 DNA标记和编码
Dubertret等将QDs装入内部镂空的磷脂高分子小球，然后进行PEG-PE表面改性并偶联寡聚核苷酸，通过碱基配对从而实现了对体内或体外特异性DNA的标记。 2001年，Han等[6]用特别的方法制作了一个直径为1.2微米、内部镂空的高分子小球，球内放入了大小不同的（CdSe）ZnS量子点，从而形成具有不同光谱特征和亮度特征的可标记到生物大分子的微球。研究人员说，根据理论计算，使用10种不同发光强度和6种颜色的量子点就可对100万个不同的DNA进行编码。然而，他们估计，实际应用中只需要5-6种颜色和6种发光强度的量子点就可给出10000-40000个可识别的编码。根据完成的人类基因组测序草图，人类具有的基因不超过40000个，该技术可对所有这些基因进行编码，这正是传统荧光染料无法比拟的新技术的意义所在。他们在实验中利用这些微球在混合的DNA试样中进行检测，研究人员准备了3种颜色的微球，并将它们连接到遗传物质的条带上，每种颜色对应一个特殊的DNA序列。这些序列作为探针用于检测DNA混合物中相对应的遗传物质，取得了初步的成功。2005年Crut等通过多颜色量子点标记DNA末端用来检测单链DNA分子，为蛋白质-DNA相互作用及核酸检测研究提取了一个新的借鉴方法。
3.3 临床诊断
量子点在临床诊断方面的应用已取得重大进展，特别是在癌（瘤）细胞、蛋白毒素的检测方面已进行了很多研究。Akerman等用偶联了多肽的（CdSe）ZnS量子点在小鼠体内检测到了血管瘤和淋巴瘤；Wu等用偶联了IgG和抗生物素蛋白（Streptavidin）的量子点成功地将乳腺癌细胞表面的Her2蛋白标记，从而实现了对乳腺癌细胞的检测；另外Goldman等研究表明偶联了抗生物素蛋白和抗体的量子点还能检测出生物体内的葡萄球菌毒素和霍乱毒素。2004年Goldman E R等又用四种不同颜色的量子点分别与抗霍乱毒素、蓖麻毒素、志贺菌毒素1和葡萄球菌肠毒素B的抗体偶联，在同一微孔板上进行四种毒素的同时检测。Elizabeth等通过量子点标记F和G蛋白，成功追踪到呼吸道合胞病毒感染过程，为量子点在病毒感染的早期迅速检测打开了大门。
3.4 信号转导方面的应用
Lidke等将量子点标记在表皮生长因子（EGF）上，然后研究erbB/HER家族（一种跨膜酪蛋白激酶）是怎样介导EGF的信号转导的。研究表明，在EGF刺激下是erb2而非erb3与EGF的受体erb1结合，从而调节EGF的信号转导。Tania等指出通过量子点标记的配体与受体结合法来研究或调节细胞的功能对生物医学研究及治疗来说都具有重大意义。他将多肽配体βNGF连接到量子点表面，并证明该多肽仍保留有生物活性并能介导胞内下游反应。
3.5 离子探针
Vu等发现用在水溶液中合成的分别由聚磷酸盐（Polyphosphate）、L-半胱氨酸（L-cysteine）、硫化甘油（Thioglycero）包被的CdS量子点可检测生物样品中的锌和铜离子，检测的最小浓度可分别达到锌0.8μmol、铜0.1μmol。
4、展望
生物技术的普遍发展趋势是开发超灵敏、快速、高通量的检测基因、蛋白质和细胞的技术，相信在不远的将来，量子点技术将成为生物标记和生物检测的新平台。虽然目前量子点技术还有许多方面需要提高，如水溶性量子点的制备、量子点与生物大分子的偶联等，但我们有理由相信随着生物学家对量子点的兴趣越来越浓和研究的不断深入，人们将更加深刻地认识量子点，量子点（特别是水溶性量子点）的制备技术将不断完善，量子点在生物科学领域中的应用也将越来越大、越来越广泛。
编辑: sunruquan
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