活体动物可见光成像仪器原理与操作流程

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发布日期：2012-02-06 14:14 文章来源：Berthold
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一、仪器原理

以NightOWL ⅡLB 983为例，来说明活体动物可见光成像系统的仪器设计原理。整个仪器由CCD配合密闭性非常好的暗箱、荧光配件、麻醉系统和软件组成。CCD镜头位于暗箱的左上方，荧光光源和光路位于右上方，动物平台（可加热，以保持观察实验动物的体温）位于暗箱的下方，麻醉系统通过管道与暗箱连接。

选择适当的CCD镜头，对于体内可见光成像是非常重要的。选用的CCD镜头对于波长450-700nm的光必须具有非常高的灵敏度和量子效率，而且由于需要探测的光源在皮下几厘米处，其噪声信号要尽可能的小。科研人员经过探索发现，背照射背部薄化冷CCD是唯一合适的选择。这种CCD芯片温度可达<-800C，在该温度下，芯片的暗电流和阅读噪音降到几乎可以忽略不计的水平，同时配合密闭性非常好的暗箱，使得该系统检测生物发光和荧光具有无与伦比的灵敏度。CCD由软件控制升降，自动聚焦，可以获得从3.5厘米到25厘米的连续视野。

成像暗箱屏蔽宇宙射线及一切光源，可以使暗箱内部保持完全黑暗，CCD所检测的光线完全由被检动物体内发出，避免外界环境的光污染。

在荧光配件的设计方面，光源采用75W的钨卤灯，该系统首先实现了荧光激发光源能量从0%-100%可调节，并通过光导纤维反馈控制激发能量在检测时间内保持稳定，有利于定量的准确性。另外，还通过采用均匀照射的激发装置、窄波带的滤光片等保证荧光成像能较好的去除背景噪音的影响，获得清晰的检测结果，较准确的定量数据。

为了对实验动物进行可见光成像，需要将实验动物进行麻醉，以获得期望的观察角度及稳定的数据。对于生物发光成像来说，由于检测的时间较长，一般建议使用气体麻醉。气体麻醉系统组成包括：气体蒸发器、诱导麻醉箱、流量调节阀、单独控制开关的五通道小鼠麻醉室、废气吸收装置等组成。在成像前，将实验动物置入诱导麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱进行观察

软件系统负责仪器控制和图像分析。软件控制镜头的焦距、CCD的升降、曝光时间、滤光片的更换和照明灯的开启等，具有友好的用户界面，操作简便。

二、实验操作流程

1. 细胞标记或动物标记等

进行生物发光实验，首先根据实验内容的不同，用荧光素酶基因标记肿瘤细胞、干细胞、病毒、药物载体或动物，或者用Lux操纵子标记细菌。用荧光素酶基因标记可通过质粒、慢病毒或逆转录病毒等方法进行。

如果进行荧光实验，就用GFP、EGFP或RFP标记肿瘤细胞、干细胞、病毒或动物等，后者用荧光染料（包括量子点）标记需要检测的物质，如抗体，药物载体等。

2. 体外预实验检测

需要检测的细胞、病毒、细菌等标记后，在活体成像前，可以通过多孔板预先检测一下标记是否成功，荧光素酶或荧光蛋白的表达强度等，并据此筛选阳性克隆、绘制标记物的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值，选择转染率相对高且稳定的一批细胞进行体内实验。对于通常进行的细胞检测来说，具体可以通过活体成像仪器检测活细胞的发光强度，也可以通过体外化学发光和荧光检测仪检测细胞裂解液的发光强度。

当用体外化学发光和荧光检测仪时，可以更准确地捕捉到发光值、更稳定的输出发光值。对于生物发光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式化学发光检测仪，如Berthold Centro LB 960。对于荧光方式而言，实验所需的仪器是微孔板式荧光检测仪，如Berthold TwinkleTM LB 970。(图1)

图1.左侧为Berthold Centro LB 960，右侧为Berthold TwinkleTM LB 970

3. 活体成像

首先麻醉实验动物，可采用异氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉实验动物。如果采用气体麻醉，可先注射底物。气体麻醉的优点是动物可以很快进入麻醉状态，一旦停止麻醉气体供应，动物会在几分钟内苏醒。

对于生物发光实验来说，接着注射底物荧光素。最佳的检测时间是在注射后15到35分钟之间。但需要注意的是，对于不同的动物模型，发光动力学过程并不完全一致，最好先进行预实验确定何时发光信号最强。

成像，对于生物发光来说，检测时间一般是1分钟到5分钟，如果信号特别弱，也可以延长到10分钟，如果信号特别强，也可在1分钟以内。对于荧光来说，检测时间是1秒以内。为节约时间，检测生物发光，最多可同时检测5只小鼠。对于荧光实验，麻醉好就可以马上检测。由于激发光照射的角度会影响检测的信号值，所以荧光实验建议每次只检测1只动物。

编辑: cq

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