单克隆抗体中建立ELISA方法的注意事项
最近园子里有很多战友问我有关在单抗制作中,如何利用ELISA筛选以及ELISA方法操作的注意事项,下面我先起个头吧,谈谈我的个人经验:)
ELISA,全称酶联免疫吸附实验,主要利用的是抗原抗体特异性结合的特点,可分为直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等。下面以间接法为例进行介绍:
1、方阵ELISA。用途:①融合前后确定鼠血清中抗体效价;②拿到单抗腹水后,需要建立ELISA方法时首先要确定包被原及抗体的最佳工作浓度。
经典的方阵ELISA:将抗原和抗体各自稀释成不同梯度浓度,结果OD值P/N>2的均判为阳性,选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为最佳工作浓度,其主要原因与酶标仪灵敏度有关。
但是,对于抗原抗体而言,由于它们被稀释成不同浓度,那么在理论上,每个抗原稀释度情况下,总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右,那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢?这就需要同时用药物做个抑制来看,哪个浓度下抑制情况好,就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度。
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2、间接竞争ELISA:在用方阵ELISA确定好抗原抗体最佳结合浓度后就可以做间接竞争ELISA了,其目的主要是考察抗体的特异性、绘制标准曲线,计算抗体对抗原的半数抑制、检测限等参数,也可以用来检测未知样品中的抗体。方法是用确定的抗原包被,在加一抗时同时加入不同浓度的标准品(一般是药物),然后加二抗,显色。用药物(即标准品)浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标,绘制ELISA标准曲线,计算相关的参数,之后就可以将未知的样品所测OD值代入曲线方程求其中抗体的含量。通常这是建立ELISA检测方法的必备项目。
标准曲线可以绘成直线或是曲线(二次方程或三次方程)。通常是选取线性比较好的几个点绘成直线。直线斜率越高说明抗体的特异性及灵敏性好,R2
值越靠近1,则说明线性关系好。曲线绘好后,有一些常用的参数,如抑制率、半数抑制、检测限、定量限、标准偏差、变异系数等等:
抑制率(%)=1-B/B0(B0为不含药物的OD值;B为含有药物的OD值)
标准差(SD)=[∑(Xi-B ) 2 / (n-1)] 1/2;
标准偏差(RSD)=SD/B
编辑: ludongcn 作者:口口草芳