罗荣城教授：类肝素酶与肿瘤微环境
南方医科大学南方医院
罗荣城 杨洋 崔瑶
罗荣城教授
PPT节选
一、概述
(一) 肿瘤微环境
肿瘤细胞周围的环境，即微环境(microenvironment)在肿瘤的发生、发展、转移起着重要的作用，并影响着治疗的反应。它包含细胞(如成纤维细胞、胶质细胞、上皮细胞、脂肪细胞、炎症细胞、免疫细胞和血管内皮细胞等)、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和细胞外分子(如 ERF、VEGF、FGF、TGFβ等)。肿瘤细胞之间以及与微环境成分的存在着各种形式的交流：向基质中分泌表达特异性蛋白分子，如VEGF 促进新生血管的形成；借助基质成分进行信息物质的传递；通过粘附或破坏细胞外基质的结构发生转移等。
ECM 是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。构成细胞外基质的大分子种类繁多，可大致归纳为四大类：胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖(glycosaminoglycan，GAG)与蛋白聚糖(proteoglycan)、以及弹性蛋白。GAG 是由重复二糖单位构成的无分枝长链多糖。其二糖单位通常由氨基已糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖)和糖醛酸组成，但硫酸角质素中糖醛酸由半乳糖代替。氨基聚糖依组成糖基、连接方式、硫酸化程度及位置的不同可分为六种，即：透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸角质素。除 HA 及肝素外，其他几种氨基聚糖均不游离存在，而与核心蛋白质(coreprotein)共价结合构成蛋白聚糖。
(二) 硫酸类肝素蛋白多糖
硫酸类肝素蛋白多糖(heparan sulphate proteoglycans，HSPGs)广泛存在于脊椎和非脊椎动物的细胞膜，它由一个核心蛋白和一条或多条硫酸类肝素(heparan sulphate ，HS)葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)链构成，其中后者为 N-乙酰化或硫酸化的葡萄糖胺单位(GlcNAc 或 GlcNS)和糖醛酸(葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸)构成的线型多糖。HSPGs 主要有三个亚家族：跨膜糖蛋白，即 syndecans(多配体蛋白多糖)，betaglycan 和 CD44v3；联接于糖磷脂酰肌醇(GPI)的糖蛋白，即磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖(glypican，GPC3，带有 G-PI 锚的蛋白聚糖)；胞外基质分泌型糖蛋白，即集聚蛋白，XVIII 型胶原和基底膜蛋白多糖。有些HSPGs 在结合的糖链上有一些改变，如结合了软骨素/皮肤素或粘蛋白等。
HS 链由高尔基体中的酶利用胞浆中的核苷酸糖装配而成，期间包含有 N 端的脱乙酰基化、硫酸化、GlcA 到 IdoA 的差向异构化、和 O 端硫酸化(形成硫酸化双糖和非硫酸化糖链相间的结构)等一系列修饰过程。这些修饰的程度有着出相当大的异质性。膜结合内皮硫酸脂酶(SULF1 和 SULF2)可以将 HS 上一些特定的硫酸根去除，细胞表面的 HSPGs 的核心蛋白可以通过蛋白裂解作用脱落，其糖苷键可以被胞外的内切糖苷酶，如类肝素酶(heparanase，HPSE)裂解，这就使得结合的配基可以被释放出来，散布到细胞以外的地方。还有数据显示 HS 可以定位于胞核，但其作用还有待明确。
由于 HS 带有大量的负电荷，HSPGs 可与以下成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族的成员及其酪氨酸激酶受体、转化生长因子(transforming growth factor，TGFs)、骨形成蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)、Wnt 蛋白、趋化因子、白细胞介素，以及酶和酶的抑制剂、脂酶、载脂蛋白、细胞外基质(ECM)和血浆蛋白，如纤维结合蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白等种类繁多的蛋白相结合，从而起到调节代谢、转运、传递信息、支持和维持集体或细胞水平的平衡等一系列重要的生理病理作用。
(三) 类肝素酶
一些特殊情况下，改构的 HSPGs 参与许多疾病的发生。内切核苷酶类肝素酶由于能够降解 HS--这一过程在妊娠、胚胎发育、炎症、血管生成和肿瘤转移等方面被证明有着举足轻重的作用--成为近年来研究的重点。
上世纪 80 年代，分别应用 B16 骨髓瘤和 T 淋巴瘤细胞首次研究了 HPSE 在肿瘤中的作用，发现 HS较完整状态下缩小了 5－6 倍。随后的实验发现了其内切糖苷酶的作用和肝素可以抑制这一作用。自此，HPSE 与肿瘤关系的研究如雨后春笋般在世界各地展开。
HPSE 基因(~50kb)定位于人 4q21.3 染色体，编码一个含有 543 个氨基酸的多肽前体。成熟的类肝素酶(50Kd，而关于其确切的分子量，一直存有争议)，N 端拥有 157 个氨基酸。不同于细菌消除酶肝素酶(heparinases) 和乙酰肝素酶( heparitinase)，HPSE-1 识别 HS 上一些特殊的结构，有实验显示 HPSE-1 识别O 端硫酸根，N 端硫酸化和艾杜糖醛酸残基则不一定出现，而 2-O 硫酸根而非 6-O 硫酸根为必需结构。也有实验显示无论是 O 还是 N 端硫酸化在 HPSE 识别切除的过程中都并非不可或缺。HPSE-1 降解 HSPGs的 HS 侧链，产物含有 10~20 个糖单位(5~7 kDa)，并显示较之 HSPGs 更有活性。[与类肝素酶 1 (HPSE-1)约 35%同源的类肝素酶 2(HPSE-2)有 3 种剪接变体，尚未发现具有酶活性，广泛分布于正常组织和细胞。本文所指类肝素酶若不加说明均为 HPSE-1。
生理情况下，HPSE-1 在滋养层细胞、内皮细胞、血小板、肥大细胞、角质形成细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等中表达。在胚胎发育时，HPSE-1 的表达先于血管和神经系统的发生步骤。病理过程中，如肿瘤、炎症、伤口愈合和糖尿病性肾脏病变等，HPSE-1 表达上调。经过观察不难发现，表达HPSE-1 的细胞有着一个共同的特征--移动性，即突破各种膜结构、细胞外基质向远处转移的能力。虽然 HPSE 的作用机理尚在研究中，可以确定的是，它通过降解 HSPGs 而释放与其结合的生长因之等，例如血管生成相关因子 FGF-2、VEGF 等，从而调节肿瘤细胞和效应细胞的行为。HPSE 还发现可以结合与除 HSPGs 以外的低密度脂蛋白受体(LDLR)相关蛋白和 6-磷酸甘露糖受体，提示 HPSE 可能存在其他的作用。
研究发现，低甲基化、和雌激素促进 HPSE 基因的表达，而甲基化、野生型 p53 则抑制其表达。转录因子 SP1 和 Ets，调控 HPSE 基础水平的转录，而早期生长应答因子(early growth response 1，EGR1)对其诱导转录有关，生长因子类、细胞活素类以及损伤、肿瘤和血管发生的过程均能强烈刺激这一诱导作用。同样的，它也可以上调一些其他蛋白的表达，如参与血管生成的 Cox-2 、HIF1a 和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase2，MMP2) 。
利用免疫荧光技术证明 HPSE 可以位于细胞核、核周和质膜，而前二者可以动员和分泌到细胞表面和其他位置。将 TNFa 和 Il-1b 作用于人血管内皮细胞和外周 T 细胞时，这种分泌明显增强 (Chen et al.，2004)，在肿瘤细胞，腺苷可以经由 P2Y G 蛋白偶联受体(GPCR)信号转导通路通过蛋白激酶 C，动员胞含体和溶酶体内的 HPSE 池，许多肿瘤细胞中的 GPCR 也发现有过表达现象。
编辑: yang 作者:丁香园通讯员
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