如何快速精确检测支原体污染？
由于支原体感染能影响几乎每一个细胞参数，改变被培养细胞的生长特点，细胞膜组成以及DNA，RNA以及蛋白表达，导致不准确和错误的实验结果，进而导致珍贵的细胞的损失，浪费人力物力和时间，所以很多研究都强调了常规筛选研究细胞系的需要，以确保观察到的结果不被污染所损害。
研究表明，支原体感染能耗尽营养物，促进代谢积累，导致pH改变，诱导或抑制细胞因子表达，并改变培养细胞的代谢、增殖特征及形态。支原体很难检测 ，因为细胞体积小，种类繁多，培养的混浊度以及对加富培养基的需求有限。此外，某些种类/菌株可能是细胞侵入性的。基于上述原因，如何对支原体污染进行的快速精确可靠的检测，是所有细胞培养的科学家最为关心的。
目前支原体检测方法众多，其中以直接培养法为金标准，但是直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成，须3－5星期才能判断，时间非常久，不适合快速精确检测；其他传统方法，例如支原体特异酶检测法，ELISA检测法，PCR检测法都非常耗时耗力，操作复杂，对实验者操作要求高，时间长，假阳性率高，为此MP Bio为大家推荐2款产品，可以短时间精确对培养的细胞进行检测；一款是DNA染料法，另一个是免疫荧光法；
基于DNA染料法支原体染色试剂盒 ：
可靠性：使用美国组织培养学会（TCA）引用的Hoechst荧光染色法（TCA procedure NO.756361）
用途广：检测支原体、细胞、酵母以及真菌；
速度快：检测全过程不超过两小时。
完美性：试剂盒包括染色剂，稀释液，封固剂以及对照样本。
支原体染色试剂盒是利用DNA荧光染色的检测方法。单层细胞50%－80%之间的融合是固定的，然后进行Hoechst染色并在荧光显微镜下观察结果。
污染物的性质可以通过它的形态、大小以及与细胞相互关系来确定。荧光显微镜下支原体是存在于中发光的微小圆点或圆柱，而其它的污染物体积要更大一些。
结果
样本应该在荧光显微镜下以400～1000×油浸镜头观察（激发波长：360nm；辐射波长：490～500nm）。通过阳性和阴性对照玻片与结果的比较，可以很容易的辨认出支原体。
在未被染污的培养物中只有细胞核被染色，偶尔会出现从死细胞或者破损细胞中释放的呈球形的微核或其他的核碎片，他们与支原体相比，体积更大并且荧光更亮。
被污染的培养中可以观察到细胞核被许多荧光小亮点包围着，他们的直径普遍在0.1～0.3um之间并且具有多形性，形态可以从球形一直到细丝状。
阴性对照
阳性对照
试剂盒组成
Hoechst染色33258-1×10ml
10×HBSS不含酚红和碳酸氢钠-1×10ml
封固剂-1×10ml
阳性/阴性对照玻片-5片
基于免疫荧光法支原体染色试剂盒：
目前有多种方法检测支原体，美国MP Bio公司也推出了一款 ImmuMark? MycoTest? 试剂盒，它运用免疫荧光方法来检测培养细胞中的支原体污染。这种方法特异性好，也相当快速，能在1小时内获得结果。
该产品中使用的单抗CCM-2特异性针对最流行支原体株系中（包括Acholeplasma laidlawii, M. bovis M. hominis, M. hyorhinis, M. arginini, M. orale, M. fermentans, M. pulmonis, M. hyopneumoniae和M. salivarium等）的共同抗原。ImmuMark? MycoTest? 试剂盒提供两种检测方法。直接检测法利用荧光标记的单抗CCM-2一步法快速筛选出可疑阳性。间接检测法利用荧光标记的单抗CCM-2和FITC标记的二抗-山羊抗小鼠IgG对极度敏感的支原体进行检测。直接法或间接法孵育样品后，用PBS冲洗掉多余试剂, 在荧光显微镜下观察结果。
直接检测：利用荧光标记的单抗CCM-2一步法快速20min筛选出可疑阳性；
间接检测：利用荧光标记的单抗CCM-2和FITC标记的二抗-山羊抗小鼠IgG对极度敏感的支原体进行检测，40min得到更加精确的结果；
结果观察： 荧光显微镜下400~600X镜头观察（最大激发波长490nm，平均发射波长520nm）
在感染细胞的边缘或在细胞之间可以观察到黄-绿荧光，感染细胞呈现明亮的红色。
受支原体M.bovis 感染的瘤细胞Ag-8（放大倍率400X）
编辑: gaowei2010
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