RNA提取的细节
RNA 抽提的“三大纪律八项注意”
纪律一：杜绝外源酶的污染。
注意一：严格戴好口罩，手套。
注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。
纪律二：阻止内源酶的活性
注意四：选择合适的匀浆方法。
注意五：选择合适的裂解液。
注意六：控制好样品的起始量。
纪律三：明确自己的抽提目的
注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。
注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。
RNase 污染的10大来源
1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。
2：枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。
3：水/缓冲液一定要确保无 Rnase 污染。
4：实验台面最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。
5：内源 Rnase所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。
6：RNA 样品RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。
7：质粒抽提质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。
8：RNA 保存即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。
9：阳离子 （Ca， Mg）在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 （1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。
10：后续实验所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。
RNase 和 DEPC 处理
1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明：37 C 与 RNA 反应，没有灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml；灭菌后，活性点为 100 ng/ml。当然，灭菌后 Rnase 仍然不能认为没有残留。
2：DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。
编辑: ludongcn 作者:taozicao
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