RNA提取的细节
3：在1M Tris， 1M HEPES， 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示，0.1% DEPC 只对 MOPS 有效，而 1% DEPC 对三种试剂都有效。
4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。
RNA 抽提的10大窍门
1：快速阻止 Rnase 活性样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 Rnase。
2：选择合适的抽提方法高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。
3：预判质量要求Northern，cDNA 文库构建对完整性要求高，RT-PCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 对完整性要求不是很高。RT-PCR 对纯度 （酶抑制物残留） 要求很高。
4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5：检查 RNA 的完整性电泳检测，28S：18S =2：1 是完整的标志，1：1 对大部分实验也是可以接受的。
6：去除 DNA用于 RT-PCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。
7：降低外源酶的污染 – 不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及 DNA 污染。
9：彻底溶解 RNA，必要时可以 65C 加热 5 分钟。
10：合适的保存方法 – 短时间可以 –20C 保存，长期请保存于 –80C。
提高 RNA 得率
首先要意识到不同得样品其 RNA 含量差别很大。高丰度 （2-4ug/mg） 的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度 （0.05-2ug/mg） 的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度 （<0.05ug/mg） 的如膀胱，骨，脂肪。
1：裂解细胞使 RNA 释放出来 – RNA 如果不被释放出来，得率是会降低的。电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也可能需要结合其它得方法，如液氮捣碎，酶消化 （Lysozyme/Lyticase）
2：抽提方法的优化。基于苯酚的方法的最大问题是分层不彻底和部分 RNA 的丢失（不能全部将上清取出）。分层不彻底是因为核酸和蛋白质含量高，可以用增加裂解液使用量或者降低样品量解决。脂肪组织要增加一步氯仿抽提。RNA 的丢失可以用反抽方法或者去除有机层后再离心的方法降低。基于柱离心式方法的最大问题是样品过量。
经典抽提小技巧
1：Phenol 纯化：将等体积的 1：1 Phenol/Chloroform 加入，剧烈混允 1-2 分钟。高速离心 2 分钟。小心取上清 （80-90%）。决不能取到中间层。可以使用等体积的反应液加入 Phenol/Chloroform 中，同样再取出上清。将两次的上清混在一起用于核酸沉淀，可以提高得率。混允时不能太温和，也不要试图取出全部上清。
2：70-80% 乙醇洗涤：洗涤时，一定要将核酸悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去。同时，在倒掉乙醇后，立即高速离心数秒，再用移液器去除残留的乙醇。室温静置 5-10分钟后，溶解。
特殊组织的抽提
纤维组织：心脏/骨骼肌等纤维组织抽提 RNA 关键在彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，故单位重量的组织 RNA 的含量就少，最好用尽可能多的起始量。一定要在冷冻条件下将组织彻底磨碎。
蛋白/脂肪含量高的组织：脑/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮状物。必须用氯仿再次对上清进行抽提。
核酸/核酶含量高的组织：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷冻条件下碾磨组织，再快速匀浆，能有效灭活核酶。但如果裂解液太粘稠 （因为核酸含量高的缘故），PCI 抽提不能有效分层；加入更多裂解液可以解决此问题。多次PCI抽提可以去除更多残留的 DNA。如果加入醇后马上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。
编辑: ludongcn 作者:taozicao
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