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RNA提取的细节

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发布日期:2009-05-26 03:06 文章来源:丁香园
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关键词: RNA 提取 细节   点击次数:

植物组织:植物组织比动物组织更为复杂。一般,大家都是在液氮条件下对植物进行碾磨的,所以内源酶作用使 RNA 降解的现象不常见。如果降解问题不能解决,几乎可以肯定是样品中的内含杂质导致。许多植物的内含杂质都会导致残留,之所以残留,往往是因为这些杂质与 RNA 有一些相似性:你沉淀我沉淀,你吸附我吸附。这些特点决定了它们是非常强的酶抑制剂。目前,商品化的 RNA 抽提试剂经过小量调整,可以适合几乎所有的动物组织,但却没有一种商品化的 RNA 抽提试剂,可以适合大部分植物组织。

样品冻融的影响

冷冻的样品可能较大,用于抽提 RNA 之前,需要切割。切割过程中样品往往出现融化 (可能是部分融化)。冷冻的样品抽提 RNA 前可能还要称重,这个过程肯定会出现融化。有时候,液氮碾磨过程中也会出现样品的融化;或者冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液中,在彻底匀浆前肯定会出现融化。实验表明,冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更容易发生 RNA 的降解。可能的原因是:冻融过程破坏了细胞内的结构,使内源酶更容易与 RNA 直接接触。

RNA 质量的判断

通常,使用电泳判断 RNA 的完整性,使用 A260/A280 判断 RNA 的纯度。理论上,完整的 RNA 拥有 28S:18S = 2.7:1 的比例,大部分资料则强调 28S:18S = 2:1 的比例。事实是,除了细胞外,从其它样品中抽提的 RNA 几乎都得不到 2:1 的比例 (此结论使用 Agilent Bioanalyzer 获得)。RNA 的电泳结果受许多因素的影响,包括二级结构,电泳条件,上样量,被 EB 饱和的程度等。使用非变性电泳检测 RNA,以 DNA Marker 做对照,如果 2kb 处的 28S 和 0.9kb 处的 18S 条带清晰,且 28S:18S > 1,该完整性可以满足绝大部分后续实验要求了。A260/A280 是一个给大家带来许多困惑的指标。首先要明确该指标用于核酸的原始含义是:纯的 RNA,其 A260/280 = 2.0 左右。纯 RNA 是‘因’,A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用,认为“如果 A260/A280 = 2,所以 RNA 是纯的”,自然会产生困惑。有兴趣的话,可以在您的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂,如苯酚,异硫氰酸胍,PEG 等,再测 A260/A280 比值。现实是,许多抽提 RNA 时使用的试剂,以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收,对 A260/A280 产生影响。目前最具有指导性的做法是:对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 的曲线具有如下特点:曲线平滑,A230 和 A260 是两个拐点,A300 接近 0,A260/A280 = 2.0 左右,A260/A230 = 2.0 左右。如果没有扫描数据,也一定要测定 A260/A230 比值,因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围 (A260 要处于 0.1 – 0.5 之间)。另外有两个有用的现象:在水中测定 A260/A280,比值将变低 0.3 左右;而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。

RNAguard:抑制组织/细胞内源酶的试剂

综上所述,确保 RNA 不降解的传统做法是:在取组织前将含液氮的容器放在手边,一旦取出所需组织,立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾钵中加入适量的液氮,再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨碎后,等待剩余液氮恰好挥发完时,立即将碾磨碎的组织移入裂解液中快速匀浆......安全的称重几乎不可能。这么严格的操作,是没有多少实验人员去认真执行的。

RNAguard 能快速抑制样品中的内源酶活性,确保动物组织/细胞中的 RNA 在 37C 一天不降解,25C 一周不降解,4C 一个月不降解,-20C 一年以上不降解。RNAguard适用的样品包括:动物组织,培养细胞,昆虫,及部分植物组织。经过 RNAguard 处理的样品可以用几乎所有常用的 RNA 方法/试剂抽提 RNA,所有的操作与用新鲜组织没有什么不同。

使用 RNAguard 的操作非常简单:在取组织前预先估计组织的重量,在一个容器中加入 5-10 倍体积的 RNAguard,放在手边。取出所需组织后,立即切割成厚度小于 0.5 厘米,放入含 RNAguard 的容器中即可。抽提前先用镊子将组织从 RNAguard 中取出,在室温进行切割和称重后,移入裂解液中快速匀浆。

如果您面临下面的情况之一,您一定会发现使用 RNAguard 的好处:

实验室没有液氮罐或者 –70C 冰箱保存样品

易降解样品的 RNA 抽提或者抽提 RNA 经常碰到降解问题

样品必须准确称重

大规模 RNA 的抽提

样品的采集 – 手术室,野外

样品的邮寄

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编辑: ludongcn 作者:taozicao

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