RNA提取的细节
植物组织：植物组织比动物组织更为复杂。一般，大家都是在液氮条件下对植物进行碾磨的，所以内源酶作用使 RNA 降解的现象不常见。如果降解问题不能解决，几乎可以肯定是样品中的内含杂质导致。许多植物的内含杂质都会导致残留，之所以残留，往往是因为这些杂质与 RNA 有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。这些特点决定了它们是非常强的酶抑制剂。目前，商品化的 RNA 抽提试剂经过小量调整，可以适合几乎所有的动物组织，但却没有一种商品化的 RNA 抽提试剂，可以适合大部分植物组织。
样品冻融的影响
冷冻的样品可能较大，用于抽提 RNA 之前，需要切割。切割过程中样品往往出现融化 （可能是部分融化）。冷冻的样品抽提 RNA 前可能还要称重，这个过程肯定会出现融化。有时候，液氮碾磨过程中也会出现样品的融化；或者冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液中，在彻底匀浆前肯定会出现融化。实验表明，冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更容易发生 RNA 的降解。可能的原因是：冻融过程破坏了细胞内的结构，使内源酶更容易与 RNA 直接接触。
RNA 质量的判断
通常，使用电泳判断 RNA 的完整性，使用 A260/A280 判断 RNA 的纯度。理论上，完整的 RNA 拥有 28S：18S = 2.7：1 的比例，大部分资料则强调 28S：18S = 2：1 的比例。事实是，除了细胞外，从其它样品中抽提的 RNA 几乎都得不到 2：1 的比例 （此结论使用 Agilent Bioanalyzer 获得）。RNA 的电泳结果受许多因素的影响，包括二级结构，电泳条件，上样量，被 EB 饱和的程度等。使用非变性电泳检测 RNA，以 DNA Marker 做对照，如果 2kb 处的 28S 和 0.9kb 处的 18S 条带清晰，且 28S：18S > 1，该完整性可以满足绝大部分后续实验要求了。A260/A280 是一个给大家带来许多困惑的指标。首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的 RNA，其 A260/280 = 2.0 左右。纯 RNA 是‘因’，A260/A280 = 2 是‘果’。现在大家却在拿 A260/A280 当‘因’用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在您的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测 A260/A280 比值。现实是，许多抽提 RNA 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收，对 A260/A280 产生影响。目前最具有指导性的做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 接近 0，A260/A280 = 2.0 左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果没有扫描数据，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围 （A260 要处于 0.1 – 0.5 之间）。另外有两个有用的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。
RNAguard：抑制组织/细胞内源酶的试剂
综上所述，确保 RNA 不降解的传统做法是：在取组织前将含液氮的容器放在手边，一旦取出所需组织，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾钵中加入适量的液氮，再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好挥发完时，立即将碾磨碎的组织移入裂解液中快速匀浆......安全的称重几乎不可能。这么严格的操作，是没有多少实验人员去认真执行的。
RNAguard 能快速抑制样品中的内源酶活性，确保动物组织/细胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一个月不降解，-20C 一年以上不降解。RNAguard适用的样品包括：动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织。经过 RNAguard 处理的样品可以用几乎所有常用的 RNA 方法/试剂抽提 RNA，所有的操作与用新鲜组织没有什么不同。
使用 RNAguard 的操作非常简单：在取组织前预先估计组织的重量，在一个容器中加入 5-10 倍体积的 RNAguard，放在手边。取出所需组织后，立即切割成厚度小于 0.5 厘米，放入含 RNAguard 的容器中即可。抽提前先用镊子将组织从 RNAguard 中取出，在室温进行切割和称重后，移入裂解液中快速匀浆。
如果您面临下面的情况之一，您一定会发现使用 RNAguard 的好处：
实验室没有液氮罐或者 –70C 冰箱保存样品
易降解样品的 RNA 抽提或者抽提 RNA 经常碰到降解问题
样品必须准确称重
大规模 RNA 的抽提
样品的采集 – 手术室，野外
样品的邮寄
编辑: ludongcn 作者:taozicao
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