你知道吗？ 详细 >>
兔单抗亲和力和灵敏度更高
相对于鼠单抗（解离常数Kd在10-9-10-10M水平），兔单抗的亲和力可提高100-1000倍（Kd在10-10-10-12M水平）。实际使用时，兔单抗的工作浓度更低，灵敏度更高，因此产生的背景更低，大大降低了假阳性的发生。用作免疫组化等用途时，有时甚至可免去抗原修复的步骤。
兔单抗能识别更多表位
很多蛋白在人类和啮齿动物中同源性很高，这些保守表位在小鼠体内免疫原性很弱，不容易产生高质量抗体。而兔做为宿主，可以更好地识别这些表位，产生针对更多表位的抗体。当然，兔也适合生产针对鼠类蛋白的抗体。
深入浅出详解单克隆抗体制备
制备单克隆抗体
1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。单抗技术的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。本文详细介绍了单克隆抗体的制备流程，包括细胞融合，抗体检测，单克隆化，抗体的生产和鉴定等。文章从理论和操作等多个层面进行探讨，并对常见问题进行了重点分析。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备
(一) 免疫方案
选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1. 颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag
1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.8～1ml 0.2ml／点)
↓3周后
第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5ml)
↓ 3周后
第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ip(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)
↓ 2～3周后
加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv
↓ 3天后
取脾融合
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
(二) 饲养细胞
在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。
小鼠腹腔巨噬细胞的制备
小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄
↓
拉颈处死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入6～8ml培养液
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟
↓
用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml
↓
加入96孔板，100μl／孔
↓
放入37℃ CO2孵箱培养
一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。
(三) 骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
编辑: wangminchao
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
