华法林药物基因组学研究进展
华法林（warfarin）是一种香豆素类口服抗凝血药，是治疗许多心血管疾病（如深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换及肺栓塞等）的一线药物，在全世界被广泛应用。临床常以凝血酶原时间（PT）及国际标准化比率（INR）作为其抗凝监测指标。但华法林在临床使用过程中，临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，即使很小的剂量也可能会导致血栓或出血。1990-2000年，美国FDA的不良事件报告系统中，华法林是引起严重不良事件最多的10种药物之一。近年来随着分子生物学的快速发展，研究发现药动学和药效学多个相关基因的多态性造成了个体差异，影响了华法林的使用剂量。其中最重要的是CYP2C9基因*1，*2，*3等位基因型，和VKORC1基因G-1639A、C1173T基因型。
CYP2C9基因多态性与华法林的关系
细胞色素P450 2C9（CYP2C9）是人类肝脏中一种重要药物代谢酶系统，代谢多种临床上常用药物。CYP2C9基因具有高度多态性，已命名34个等位基因，最常见的等位基因型是CYP2C9*1型（野生型）、CYP2C9*2（C430T，Arg144Cys）型和CYP2C9*3（A1075C，Ile359Leu）型。在白种人中CYP2C9*2型发生率在10％以上，亚洲人中这种变异非常稀少。CYP2C9*3型突变在白种人中发生率在7.5％-10％之间，亚洲人中约3％左右。CYP2C9*2型和CYP2C9*3型由于基因突变导致CYP2C9酶活性降低，影响其底物药物在体内的代谢，造成药物疗效和毒性的个体差异。研究发现CYP2C9*2和CYP2C9*3突变型与野生型相比对华法林的内源性清除率（Vmax/Km）分别要降低5和25倍。有报道CYP2C9*3突变型会减慢S-华法林的代谢，突变的病人容易出现出血等并发症，故突变的病人应减小华法林的使用剂量。
美国的一项回顾性研究[1]对200名长期接受华法林治疗的患者进行随访，研究了CYP2C19*2和CYP2C9*3型突变与华法林治疗中的过度抗凝及出血事件的相关性。结果表明，与野生型患者相比，携带任何突变型的个体在治疗初始阶段需要的维持剂量较低，且到达稳态剂量所需时间更长（P=0.004）。同时，这些突变型携带者更容易发生抗凝过量（INR>4.0）且发生危及生命的出血事件的风险度显著升高（HR: 2.39; 95% CI: 1.18–4.86）。研究提示，在用药前检测CYP2C9基因型有助于华法林用药剂量的调整并减少药物不良反应的发生。
Aitha等[2]随机选取了52名需要抗凝治疗的患者和100名健康的英国人，研究发现CYP2C9*2和CYP2C9*3这两个多态性等位基因在华法林低剂量需求人群中的发生率明显增加，为正常人群的6.21倍，且低剂量患者发生主要出血并发症的风险为正常对照组的3.68倍。这表明CYF2C9基因型与华法林的敏感性之间存在着很强的关联性。
中国人华法林代谢主要与CYP2C9*1和CYP2C9*3有关。郑策等[3]针对123名服用华法林的汉族患者研究了CYP2C9遗传多态性对华法林剂量和抗凝效果的影响。研究发现，CYP2C9*l纯合体组和CYP2C9*3杂合体组华法林稳态剂量（P<0.01），治疗初始阶段抗凝过量的发生率（P<0.01），达稳定剂量-效应关系的时间（P<0.01）均有显著差异。研究指出，对CYP2C9突变的筛选可以帮助临床调整华法林剂量，减少不良反应的发生。
VKORC1基因多态性与华法林的关系
研究表明，含有了γ-谷氨酸残基的维生素K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、X，以及蛋白c和s，必须经过维生素K依赖性羧化酶（γ-谷氨酸基羧化酶）的羧化作用才能成为有活性的凝血因子。在羧化过程中，耦联氢醌型维生素K被氧化成环氧型维生素K。华法林作为维生素K拮抗剂通过阻断维生素K还原，使得含有谷氨酸残基的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、X，以及蛋白C和蛋白s停留在没有抗凝血生物活性的前体阶段。这类蛋白与氧化失活的维生素K结合，进一步阻碍维生素K环氧化物由环氧型向氢醌型转变。氢醌型维生素K必须通过环氧型维生素K被还原才能使维生素K依赖性凝血因子前体被持续羧化成有活性的凝血因子。体内环氧型维生素K被还原为氢醌型维生素K由维生素环氧化物还原酶复合体（VKORC）完成，华法林主要是抑制该酶而产生作用。维生素环氧化物还原酶复合体的编码基因VKORC1的基因多态性是影响个体之间、民族之间剂量差异的一个重要因素。
VKORCl主要有4种单倍体：VKORCl*1（野生型）、*2（6853G>C）、*3（9041G>A）和*4（6009 C>T）。VKORCl*2为亚洲人中的主要单倍体，其中2个常见的基因多态性为内含子1173C>T和5’上游区的-1639G>A。许多研究证明-1639G>A多态性和1173C>T多态性与华法林抗凝疗效密切相关，不同基因型患者所需华法林剂量差异明显。VKORC1-1639G>A或1173C>T和CYP2C9基因多态性解释了50％华法林的个体剂量，因此测定这两个基因可以指导临床用药。
Yuan等[4]发现VKORC1启动子的多态性（-1639G>A），在11例华法林敏感的病人中（≤1.5 mg·d-1）全为AA基因型，而在华法林抵抗的5个病人中为AG型或GG型；在随后的104个随机选择的病人中AA（n=83）基因型所需的剂量也低于AG或GG基因（n=21）（P<0.0001）。另外报道指出，AA基因型频率在华人和高加索人之间的分布不同。华人中，AA纯合子基因型占绝大多数（82.1％），而高加索人AA纯合子基因型频率却很低（14.2％），从基因型频率在两族之间的差异与临床上发现的华法林维持剂量差异相一致，因此VKORC1基因多态性可能是导致人群差异的原因。
D’Andrea等[5]发现了VKORC1的两个单核甘酸多态性，1173C>T和3730G>A（3’非翻译区）。研究发现1173CC基因型患者的平均华法林剂量（6.2 rng）较CT型患者（4.8mg，P=0.002）和TT型患者（3.5mg，P<0.001）显著增高。另外，报道指出，VKORC1和CYP2C9解释了1／3的华法林剂量的个体差异。
Xie等[6]在健康中国青年志愿者（n=24）中，研究VKORCl不同基因型对华法林反应的差异。将志愿者随机分为华法林3mg·d-1组和6mg·d-1组，结果发现用药第3天，携带-1639AG和1173TC基因型者较-1639AA和1173TT携带者的INR显著降低（P=0.01），且在3mg组中，基因型的差别导致INR值的差别更加明显（P<0.005）。说明VKORC1基因多态性能够影响患者在治疗初始阶段对华法林的反应。
杨剑等[7]收集了临床使用华法林的患者191例，并检测CYP2C9和VKORC1基因型，结果发现，VKORC1l（-1639G>A）GA+GG组，华法林平均剂量明显高于AA组（3.36mg/d vs 1.75mg/d，P<0．01）。CYP2C9*1*1型患者华法林平均剂量高于杂合子*1*3型患者（2.06mg/d vs 1.55±mg/d，P<0.05）。多元线性回归分析指出，年龄、体重以及VKORC1基因型分别解释了约9.3%、7.4%、51.9%的个体间剂量差异，包括年龄、体重、VKORC1和CYP2C9基因型的多变量模型能解释64.1%的个体间剂量差异。
药物基因组学指导华法林剂量
华法林的合适剂量很难确定，不恰当的剂量导致较高的不良反应发生率。人口统计学、CYP2C9和VKORCl基因的变异与华法林的需要量之间有显著相关性。国际华法林药物基因组学联合会（The International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium）通过大量数据，制订了华法林的剂量运算法，它明显优于传统的固定剂量方案[8]。联合会由4大洲9个国家的21个研究组组成，共4043名以华法林治疗患者的临床和基因学资料，分析CYP2C9*2、CYP2C9*3和7个VKORCl基因的SNPs。实验分别对3组不同剂量的患者进行测试，小剂量组（每周≤2l mg，n=324）、中剂量组（每周21～49 mg，n=560）和大剂量组（每周≥49 mg，n=125）。药物基因组学运算法比临床运算法或固定剂量法（每周35 mg）能更好预测小剂量组患者的需要剂量：根据药物基因组学运算法，有35％患者的预测剂量在实际剂量的20％范围内；而临床运算法为24％；固定剂量法为0％（P<0.001）。对于小剂量组华法林达理想剂量的患者百分率，药物基因组学运算法明显高于临床运算法和固定剂量法（P<0.001）；高估剂量的患者百分率也明显低于临床运算法和固定剂量法（P<0.001）。而对于大剂量组华法林达理想剂量的患者率，药物基因组学运算法明显高于临床运算法和固定剂量法（P<0.001），低估剂量的患者百分率也明显低于临床运算法和固定剂量法（P<0.001）。研究指出，药物基因组学指导的华法林剂量调整对大剂量和小剂量需求患者的准确用药大有裨益。
Anderson等[9]进行了药物基因组学指导华法林剂量调整的随机双盲研究，受试者被随机分配为药物基因组（n=101）和标准剂量组（n=99），药物基因组检测CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORCl C1173 T的基因型，根据上述3种变异基因及患者的年龄、性别和体质量调整华法林剂量，并常规监测INR。药物基因组的平均初始剂量与标准剂量组之间无显著差异（每周35．5 mg vs 35mg），前者个体间剂量差异可达（7～56）mg，而后者所有患者均为1个剂量。研究发现，药物基因组学能较准确预测需大剂量的野生型基因和需小剂量的变异基因携带者的华法林剂量。在其指导下，能更精确预测稳态剂量，因此很少需要调整剂量或调整的幅度更小。2组超出INR比例无显著差异；但野生型基因携带者与多种变异基因携带者之间，超出INR比例存在显著差异（药物基因组：29％；标准剂量组：39％）。因此研究认为，药物基因组学结合临床部分因素，可以明显提高华法林初始剂量预测的准确性和有效性。
另外，Wen等[10]对108名中国汉族人的CYP2C9和VKORCl的多态性进行了前瞻性研究。利用基因型剂量方法，83％患者在第2周，INR达稳定的治疗范围，且未发生出血和血栓形成事件。10％患者INR>4，未发生出血。第12周时。69％患者维持剂量与预测一致。包括年龄、体表面积和VKORC1、CYP2C9基因型的剂量算法能解释62%的个体差异。研究表明，以药物基因组学指导的给药能提高INR稳定性，减少不良反应，并达到用药的高灵敏度和有效性。
研究CYP2C9和VKORC1基因多态性与华法林效应多样性之间关系，对华法林给药剂量计算的应用前景非常广阔，它可以确立最佳给药方案，提高药物的安全性，弥补了常规用药中通过出现不良反应再调整剂量的不足，为临床个体化给药开辟了一个新的途径。
参考文献
[1] Mitchell K. Higashi, etc. JAMA, 2002
[2] Guruprasad P Aithal, etc. Lancet, 1999
[3] 政策等，中国药学杂志，2008
[4] Hsiang-Yu Yuan, etc. Human Molecular Genetics, 2005
[5] Giovanna D'Andrea, etc. Blood, 2005
[6] Xie Shuang，Chinese Medical Journal, 2009
[7] 杨剑等，中华心血管杂志，2008
[8] UKPMC Funders Group, N Engl J Med, 2009
[9] Jeffrey L. Anderson, Circulation, 2007
[10] M-S Wen, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2008
编辑: cq
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