PicoGreen荧光法定量生物制品中DNA残留
1．应用说明
疫苗是现代疾病预防中常用的控制方式。如今许多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组乙肝疫苗、狂犬病疫苗等大多数疫苗都采用细胞培养的方法生产。其中，疫苗的纯化是关键问题，我们需要尽可能的去除宿主细胞DNA和宿主蛋白。假若宿主细胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人体将会产生不可预料的后果。
常规的DNA含量的检测方法是在260nm（A260）处测其吸光值。这种方法的主要缺点是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大，并且还会受到核酸制备过程中污染物的干扰，无法区分DNA和RNA，而且这种方法不灵敏（5μg/mLdsDNA溶液A260=0.1）。
在2010年版《中国药典》的征求意见稿中，针对生物制品的DNA残留检测，药典提供了两种检测方法。其中的PicoGreen定量检测方法简单、方便，被多家生物制品厂所选择，成为生物制品残留DNA检测的标准。
ModulusTM单管型多功能检测仪是Turner Biosystems公司的一款产品，具有发光、荧光和吸收光检测功能。使用ModulusTM单管型多功能检测仪，可以通过PicoGreen来精确定量dsDNA。如果使用微量适配器，可以将检测体积减少到100ul以下，节约样品的同时也节约了染料的成本。
2．所需器材
ModulusTM单管型多功能检测仪（9200-003）；微量适配器（9200-928）；微量比色皿；PicoGreen试剂。
3．试验方案
3.1 试剂准备
PicoGreen是以1mL的浓缩液形式保存在无水的 DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天，配制 2×PicoGreen试剂的工作溶液，用 1×TE按 1：200的比例稀释浓缩液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5）。如果要准备足够的工作溶液测定20个样品，可在20mL 1xTE中加入100μL PicoGreen dsDNA定量试剂。由于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容器中配制。PicoGreen试剂见光易降解，所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。
溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。
3.2 DNA标准曲线
3.2.1标准品工作液的配制：Sigama小牛胸腺嘧啶DNA干粉（货号：D4522-1MG）1mg（Tris，Nacl等浓度已成标准体系），加入1mL双蒸水，配制成1mg∕mL的标准品工作液；
3.2.2标准品工作液稀释：
（1）母液稀释：取10ul（1mg∕mL）标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓度稀释成10ug∕mL，取10ul（10ug∕mL）标准品工作液加入到990ul TE溶液中，浓度稀释成100ng∕mL；
（2）倍比稀释：取800ul （100ng∕mL）的标准品工作液加入到200ul TE溶液中，浓度达到80ng∕mL（药典规定：荧光染色方法DNA含量在1.25-80 ng/mL范围线性较好， 该法DNA检出限为0.3 ng/ml），取500ul（80ng∕mL）的标准品工作液加入到500ul TE溶液中，浓度稀释到40ng∕mL；依次倍比稀释，配成20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml的标准品溶液；
3.2.3标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取100ul混匀，避光室温放置5min。
表1：标准曲线的溶液制备
3.2.4使用ModulusTM单管型多功能检测仪的Blue荧光模块检测样品的荧光值：将混合后的溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散气泡。以1×TE缓冲液为blank，测定样品和空白对照的荧光值；用标准品溶液的浓度（ng/ml）对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线（图1、图2）；
表2：标准曲线样品检测值
编辑: muoquan
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