使用荧光素酶检测RNAi效果
原理:
RNAi (RNA interference) 即RNA干涉,是由双链RNA(dsRNA)介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。在RNAi研究中,我们可以人工合成特定的dsRNA,对目的基因进行干涉。但设计的dsRNA不同,实际干涉效果差异很大。所以有时候就需要筛选dsRNA片断。
PsiCHECK载体将RNAi与荧光素酶发光相偶联:当RNAi有效时,转录的荧光素酶RNA将被降解,无发光反应;当RNAi无效时,转录的荧光素酶RNA将翻译为荧光素酶,并参与发光反应。通过检测发光即可反应RNAi的效果。
以PsiCHECK-2载体为例:将RNAi的靶片段插入到hRlu片段下游的多克隆位点中,然后将构建好的载体与特定的dsRNA片段或能转录dsRNA的载体共转染进细胞;转然后,细胞培养一定时间,裂解细胞使用ModulusTM多功能检测仪(http://www.yph-bio.com/equip/modulus/modulus.asp)检测荧光素酶的表达情况。
反应:
RNAi反应示意图之一
RNAi反应示意图之二
编辑: yishuitan 作者:丁香园通讯员