应用水母发光蛋白检测钙离子（Ca2+）浓度
应用说明
Ca2+作为普遍的第二信使在细胞信号转导过程中起着非常重要的作用,而人们对Ca在信号转导中作用的认识,则很大程度上取决于Ca2+测定技术的发展。最近十几年来出现的新型探针有Aequorin (水母发光蛋白) , yellow cameleon等。而Aequorin 发展最快也最受人们的关注。Aequorin 作为检测钙离子新型探针的使用,极大地推动了人们对Ca2+在细胞信号转导过程中作用的认识进程。
水母发光蛋白由189个氨基酸组成,具有3个Ca2+结合的EFhand结构。腔肠荧光素(coelenterazine)是一个分子量约400 Da 的疏水基团,它可以自由穿越细胞膜。当3个Ca2+与水母发光蛋白结合后,引起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键破裂,腔肠荧光素被氧化为coelenteramide ,并释放出CO2和一个质子,同时放出波长为469nm的蓝色光。
水母发光蛋白一旦和Ca2+反应即丧失发光功能,因此当一部分水母发光蛋白与Ca2+反应时,被消耗水母发光蛋白的发光强度能反映出Ca2+浓度变化,而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与Ca2+浓度之间存在线形关系。
实验方法：
以检测拟南芥中Ca2+浓度为例
1.转基因拟南芥
使用农杆菌转化拟南芥，形成转水母发光蛋白拟南芥植株。
2.水母发光蛋白与腔肠素结合
将拟南芥放入浓度2.5mM的腔肠素溶液中，避光孵育16-20小时。
3.检测不同温度处理时钙离子浓度变化
a)将孵育过腔肠素的拟南芥幼苗放入盛有100mL水(室温)的离心管中, 静置1-2分钟后, 再放入TD-20/20n发光检测仪(http://www.yph-bio.com/equip/GloMax/TD2020.asp)中检测发光值；
b)然后, 迅速加入0.6 mL (0°C)水, 继续记录其发光值。
编辑: yishuitan 作者:丁香园通讯员
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