双荧光素酶报告基因分析
2. 所需器材
•Veritas™微孔板发光检测仪（http://www.yph-bio.com/equip/GloMax/Veritas.asp）(P/N 9100-002)
•96 孔白板(E&K Scientific EK-25075)
•Dual-Luciferase Reporter®荧光素酶检测系统(E1980)
•P200 移液器和枪头
3.实验方案
3.1 试剂制备
荧光素酶检测缓冲液II 和荧光素酶检测底物：使用所提供产品，－20℃储存，可以稳定保存6 个月，荧光素酶检测底物可以4℃保存1 个月。将荧光素酶检测缓冲液II 加入荧光素酶检测底物中，配制DLR 工作液，颠倒混合，直到底物彻底溶解。配好试剂最好当天使用，也可以将配好试剂分装，-20°C 储存1 月，-70℃储存1 年。
Stop & Glo®底物和Stop & Glo®底物缓冲液：使用所提供产品，－20℃储存。
Stop & Glo®底物溶解缓冲液：使用所提供产品，低于25℃储存。在玻璃管或者硅化聚丙烯酸树脂管中将50×Stop & Glo®底物稀释成1×Stop & Glo®工作液。颠倒混合，工作液最好当天使用，也可以将工作液分装，-20°C 储存2 周。
被动裂解缓冲液：用去离子水将5x 被动裂解缓冲液稀释成1x 的，低于25°C 保存。
注：因为荧光素酶活性受温度影响，在定量发光检测过程中Dual-Luciferase®荧光素酶缓冲液II 和Stop & Glo®缓冲液应始终保持室温。混合试剂冻存后再次使用，为确保试剂性能，应在低于25℃条件下溶解。溶解后充分混匀，最简单的方法是室温水浴溶解。
3.2 仪器安装
3.2.1 双击Veritas图标运行软件；
3.2.2 从"Welcome to Veritas"对话框中点击"Run Promega Protocol"；
3.2.3 浏览"DLR"文件夹，选择合适的检测程序，例如DLR检测中使用的是单注射器那就选择"DLR with one injection."；
3.2.4 点击"Options"选择需要检测的孔，默认值是预置了Promega 操作方案的最佳测量值。但也可以根据自己需要在"Other Options"面板中进行检测时间，延迟时间和加样体积的调整。修改结束，点击"Apply Changes"确认修改，或者点击"Save Protocol As"保存修改方案。另外也可以点击"Options"返回"Main Dialog Box"；
3.2.5 在"Main Dialog Box".中输入个人信息，例如"Experiment", "Operator", "Plate No.", and "Notes"。
3.3 样品分析
3.3.1 准备含有裂解细胞培养物的96 孔板；
注：为了保证数据良好的重现性。加入试剂前，室温下平衡细胞培养基；
3.3.2 准备注射器。将注射器1 进样口放入LAR II，将注射器2 进样口放入Stop & Glo®试剂瓶，在"Main Dialog Box"上用"Prime"键对注射器进行初始化；
注：不能混用注射器。Stop & Glo®试剂对萤火虫荧光素酶活性有猝灭作用。建议一个注射器专门吸入Stop & Glo®，另一个专门吸入LAR II；
3.3.3 样品板放入Veritas™微孔板发光检测仪中，点击“Start”开始检测。检测结束后，所有需要检测的样品检测结果会以Excel 表格形式显示，如检测中遇到其他问题，请参考问题导读获取更多信息；
3.3.4 检测结束就可以通过Excel 进行数据分析；
3.3.5 检测结束取出检测板。选择"Reverse Purge"将管路中剩余试剂回收到试剂瓶，而后彻底清洗注射器。
4. 相关文献
1. Ow, D.W. et al. (1986) Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science 234, 856—9.
2. De Wet, J.R. et al. (1987) Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells, Mol. Cell. Biol. 7, 725—37.
编辑: yishuitan 作者:丁香园通讯员
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