使用发光检测试剂盒aCella™ -TOX检测细胞毒性
3.2仪器准备
3.2.1 双击Veritas图标运行软件。
3.2.2 在"Welcome to Veritas"对话框中点击"Create New Protocol"
3.2.3 提示有新的工作方案生成时，选择"0 injectors"。
3.2.4首次运行前修改延迟时间，测量次数和重复测量延迟时间，"Integration time"选择为1s。
3.2.5 接下来，选择想要检测的孔。可以选择"Save Protocol As"以便将来使用，或者选择"Finish"不保存运行该方案。
3.3 样品分析－细胞毒素
3.3.1 对照
A．阴性对照：1. 仅仅用细胞培养基铺板，三次平均来获得测量背景值；2. 可以用未处理细胞或者溶解于溶剂/机械法处理的细胞来铺板。
B．阳性对照：1. 使用裂解液处理细胞检测释放的总GAPDH，每100ul样品中加入5-10ul 0.2％ NP-40。
注：有些细胞系可能需要高浓度NP 40才能裂解，但我们建议尽可能使用较低浓度的裂解液。
3.3.2 100ul板孔中，每孔要有500-10,000个细胞，做3个平行。细胞可以种入无血清培养基或者10％血清的培养基。但是若使用10％血清培养基，种入细胞每孔应是10,000-20,000个。
技术提示1：实验开始前，测定所检测细胞系对aCella-TOX系统的线性应答范围非常重要，因为在不同细胞系中GAPDH表达会有变化。滴加细胞溶液(Cell Technology 建议每孔 1,000-20,000 个细胞)，接着向每孔中加入细胞裂解液，孵育时间与检测时间相同。而后加入酶分析和检测试剂，测量发光值。使用测量值在线性范围内的细胞浓度做进一步实验。
3.3.3 样品中加入细胞毒素。
3.3.4 根据实验方案孵育以后：
A．在阳性对照样品中加入5-10ul细胞裂解液。
B．而后向样品和阳性对照，每孔中加入100ul 2×酶检测试剂。
3.3.5 每孔中迅速加入50ul稀释检测试剂(Vial B)，为了获得最大信号值，孵育2-5min。
技术提示2：延长孵育时间或许会使分析数据超出线性范围，酶试剂持续生成ATP直到反应组分的任何一种耗尽。建议5－25min内在不同时间点读值，以得到最佳线性。
3.3.6 样品板放入ModulusModulus微孔板多功能光度计中点击“Start”开始测量。每行所选择孔检测完后， RLU值会以Excel电子表格形式显示。如果测量中遇到其他困难，请参考疑难解答获取更多信息。
3.3.7 一旦检测结束，就可以通过Excel进行数据分析。
3.3.8 检测完成后取出样品板。
3.3.9 结果计算 A． 细胞毒素%=100×（实验样品－阴性对照）/（GAPDH最大释放值－阴性对照）
3.4 样品分析－细胞耦联/抗体耦联细胞毒素
3.4.1 对照
A．阴性对照： 1．测目标细胞和受动细胞自然释放的GAPDH值，做三次平行实验。测量前参考技术提示1。
B．阳性对照： 1．目标细胞铺板，做三个平行，细胞裂解液处理细胞(vial D: 5-10 µL per well)测量GAPDH的最大释放值
3.4.2 每孔目标细胞数为500-10000。(注：分析抗体耦联细胞毒素，目标细胞需要和要研究抗体孵育，洗脱去除多余抗体，然后铺板，残余抗体不会干扰aCella-TOX分析信号。)
3.4.3 根据实验方案孵育后，向目标细胞阳性对照孔中加入5-10ml细胞裂解液，静置5min。
3.4.4 然后向每孔加入100ml 2×酶分析试剂（vial A）
3.4.5 每孔立刻加入50ml稀释检测试剂(vial B)，为获得最大信号值，需孵育样品2-5min，参考技术提示2。
3.4.6样品板放入Modulus微孔板多功能光度计中点击“Start”开始测量。每行所选择孔检测完后， RLU值会以Excel电子表格形式显示。如果测量中遇到其他困难，请参考疑难解答获取更多信息。
3.4.7一旦检测结束就可以通过Excel进行数据分析。
3.4.8 取出样品板
3.4.9 结果计算
A. 目标细胞：受动细胞1：1细胞毒素％＝100×【（B1平均值－A平均值）－C1平均值】/(E-D)
A＝目标细胞自发GAPDH释放值
B＝目标细胞受受动细胞影响GAPDH释放值(Target:Effector)
C＝受动细胞自发GAPDH释放值，不同比率下的受动细胞
D＝培养基背景值
E＝目标细胞GAPDH最大释放值
4 参考文献
1. Methods and compositions for coupled luminescent assays. United States Patent 6,811,990 Corey and Kinders, issued November 2, 2004.
2. Corey, M. J. and Kinders, R. J. (2005) "Coupled
Luminescent Methods in Drug Discovery: 3-Min Assays for Cytotoxicity and Phosphatase Activity" Drug Discovery Handbook, Ed. Shayne Cox Gad, published by John Wiley & Sons, Inc., pp. 689-731
3. Corey, M.J., et al., "A Very Sensitive Coupled Luminescent Assay for Cytoxicity and Complement-Mediated Lysis," Journal of Immunological Methods 207:43-51, 1997.
编辑: yishuitan 作者:丁香园通讯员
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
