蛋白质纯化——下游纯化
4、蛋白质的来源
（1）天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
（2）重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：
a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
表4 不同来源的蛋白质样品概述
来源 目的蛋白含量 复杂度 杂质类型 色谱前预处理
天然 低 复杂 固体颗粒，杂蛋白，核酸，蛋白酶 去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶
重组 细胞质 较高 复杂 细胞碎片，宿主蛋白，核酸，蛋白酶 去除固体颗粒与核酸，抑制蛋白酶
包涵体 很高 低，主要为目的蛋白 高速离心分离，溶解、复性
外周质 高 中等 宿主蛋白，蛋白酶 去除固体颗粒
分泌 低 低，主要含培养基蛋白 培养基，蛋白酶，宿主蛋白 去除固体颗粒，抑制蛋白酶
三、常用液相色谱纯化方法
1、凝胶过滤（gel filtration,molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱，gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱）。
根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。
凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
要点： 采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。
表5 常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数
系列 名称 分离范围 颗粒大小 应用
Superdex prep grade系列 Superdex 30PG 小于10000 24~44微米 小肽
Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白
Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白
Superose系列 Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病毒
Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸
Sephacryl HR系列 Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白
Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白
Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白
Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体
Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米 <1078bp的DNA片断
Sephacryl S-1000 ~100000000 40-105微米 <20000bp的质粒、巨大多糖、病毒
Sepharose FF系列 Sepharose 6 FF 10000~4000000 45~165微米 质粒、病毒
Sepharose 4 FF 60000~20000000 45~165微米 病毒，rHBsAg等巨大分子
Sepharose xB（CL-xB）系列 Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微米 大分子复合物
Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微米 病毒等大分子
Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微米 大分子
Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物
Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物
Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120
Sephadex G-15 小于1500 40-120
Sephadex G-25
coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲液用
Sephadex G-25
medium 1000-5000 50-150
Sephadex G-25
fine 1000-5000 20-80
Sephadex G-25
superfine 1000-5000 10-40
Sephadex G-50
coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽的分离
Sephadex G-50
medium 1500-30000 50-150
Sephadex G-50
fine 1500-30000 20-80
Sephadex G-50
superfine 1500-30000 10-40
Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离
Sephadex G-75
superfine 3000-70000 10-40
Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白的分离
Sephadex G-100
superfine 4000-100000 10-40
Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-150
superfine 5000-150000 10-40
Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-200
superfine 5000-250000 10-40
编辑: ludongcn 作者:项小龙
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