蛋白质纯化——下游纯化
重组蛋白纯化的基本策略
一、融合表达蛋白的纯化：
融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或（His）6肽段，从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharose凝胶进行亲和色谱分子，一步可以达到~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。
二、包含体表达蛋白的纯化：
在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。以下以rhGM-CSF（重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：
E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1:70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于Phenyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharose FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF,同时，DNA及内毒素去除率均很高。如下表所示：
步骤 体积（ml） 蛋白（mg） 内毒素（EU/ml） DNA（pg/ml）
起始（复性样品） 4344 490 421 180
HIC疏水柱 880 220 243 0.46
AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14
GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08
三、周质表达的蛋白的纯化：
可用渗透压休克方法，使周质释放，然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱（STREAMLINE系列凝胶），菌体穿过而表达的蛋白上柱。
各种色谱的主要影响因素
一、凝胶过滤色谱：
一般来说，凝胶过滤色谱的结果好坏直接取决于凝胶柱的柱效（每米多少理论塔板数），而影响柱效的因素主要有：
1、凝胶本身性质：
每一种凝胶均有其合适的分离范围，应选择合适的凝胶进行分离。同样分离范围的凝胶颗粒越细的，柱效越高。
2、色谱柱装填的好坏：
凝胶过滤色谱柱装填完后，一般可以用丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性，一般对于平均颗粒直径在30~34微米的Superose PG、Superdex PG系列凝胶，柱效应在9000以上，而颗粒平均直径在90微米的Sepharose FF凝胶柱效应在3000以上。通常，越是分辨率高的细颗粒凝胶对于装柱的技术要求越高。
除了柱效以外，影响分离的因素主要有：
a、色谱柱的长短，一般较长的柱分离较好，L/D>20.但一般商用色谱空柱长100cm左右，最多可以装到90~95cm高左右，如果仍不能取得满意的分辨率，可以用两根相同的凝胶柱，用SRTC-2接头连接后，可以提高分辨率40%.
分离度正比于柱长的平方根。
b、样品浓度，在蛋白浓度小于50mg/ml并且粘度小于5cP（厘泊）的条件下，样品浓度对于分辨率影响较小。
c、上样体积：
上样体积越小分辨越好，不同的凝胶具有不同的推荐上样体积，如下表：
凝胶类型 推荐上样体积（%Vt）
Sephadex 2-5%
Sepharose 2-5%
Sephacryl HR 1-2%
Superdex PG 1-2%
Superose PG 1-2%
Superdex 0.5%
Superose 0.5%
编辑: ludongcn 作者:项小龙
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