蛋白质纯化武器—工艺篇
（6）SP Sepharose FF柱纯化
pH5.8,20mM PB平衡SP柱，Q柱穿透样小心调节pH5.8后上样SP柱，目标蛋白吸附于柱上。 pH5.8,20mM PB,90mM NaCl洗脱杂蛋白峰。然后从90mM-300mM NaCl做线性梯度洗脱。分段收集洗脱峰，HPLC检测。
点评：此步SP柱纯化是关键性步骤，使得目标蛋白从SDS-PAGE纯度95%上升到HPLC纯度大于95%.
一般对离子交换层析来说，与等电点相差2个pH单位就可以有效吸附。此步的缓冲体系pH为5.8,这个差值达到了4,比较特殊。确定此pH值经过了多次的小试研究，高点的pH蛋白A都难以吸附完全，也不利于梯度洗脱分离，这点当时很难理解。后来在研究蛋白A的理论滴定曲线时，终于找到了理论依据。原来蛋白A的理论等电点虽然为9.7,但在滴定曲线上，从9.7到6.5的很长一段曲线都是平缓的。也就是说从pH9.7到pH6.5,蛋白A所带的净正电荷都很少，只有0-1个单位左右。当pH为5.8时，蛋白A的净正电荷达到3个单位，这时才能有效吸附。通过本例也可以发现，决定蛋白吸附的不是等电点的差异多少，而是所带净电荷的多少。可能一个蛋白质x比蛋白质y的pI高，但在某个pH时，蛋白y可以吸附阳离子柱，而蛋白x却吸附不好。所以，在理论上，做纯化要善用滴定曲线的差异，特别是小分子的蛋白质，它们普遍有着净电荷与pH不敏感的现象。
90mM NaCl洗脱杂蛋白峰和后面的线性梯度洗脱都是多次小试试验优化的结果。细心点的战友可能会发现，此步中，样品在上柱前调节完pH后并没有经过换液或透析操作，就直接上样了。样品的pH从8.0调节到5.8,体系的电导值会增加很多。大约会从2ms/cn上升到8ms/cn左右。通常这种样品是不能直接上样离子交换柱的。但本例的蛋白A在pH5.8时吸附SP柱很好，90mM NaCl不会洗脱下，所以可以直接上样。在做工艺优化时，也是有意识的想省略掉换液操作这一步，而将体系的pH适当降低了，实际在做实验时，pH6.2条件蛋白A也可以吸附SP柱，但样品的电导值必须降低，也就是要做换液操作或大量稀释。
线性梯度洗脱，分段收集洗脱峰是本工艺中的一个弱点。蛋白A的总纯化收率主要损失在这一步。做过不少试验，想把梯度洗脱改成分段洗脱方式，均未获得成功。可能是杂质与目标蛋白的差异很小吧，分段洗脱对收率的影响更大。好在本例的蛋白表达量很高，而且作为药用蛋白的使用量很低，所以纯化收率的多少对生产的总成本影响不大，它的生产成本主要在冻干和包装上。
至此，蛋白A的纯化工艺全部完成。
编辑: ludongcn 作者:skykiller
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