蛋白质纯化武器—工艺篇
五、包涵体处理
前面说过对纯化来说，我不赞成包涵体的提法，但为了表述方便还是不妨借用一下，谁…谁在拍砖头啊。
（1）包涵体洗涤
我的蛋白是包涵体表达，用什么来洗涤啊？此类问题战友常问。其实还真不好回答。用什么溶液来洗涤包涵体也是与后续纯化方法相关的。例如，后面接离子交换层析，洗涤液不能加盐；后面接Ni柱，洗涤液不能加EDTA等等。罗列了一些可用的洗涤液成分如下，根据自己的需求来增减。
pH6.0-pH9.0:高pH使得包涵体倾向于溶解，杂蛋白也去除的好些，但高pH有可能使目的蛋白降解。
10-50mM PB,10-50mM Tris:维持缓冲环境，后接离子交换时选低一点的浓度。
0-0.5N NaCl:盐洗涤有助于核酸的去除，多年前有位做干扰素的可爱老太太教我，盐洗涤后包涵体的OD280/260的比值（溶解后）会升高很多，也就是核酸去除很多，有利于后续纯化。
0.5-5mM DTT:提供还原环境，打开蛋白中的二硫键，使得包涵体倾向于溶解，有利于杂蛋白的去除。但浓度太高了使得包涵体真的溶解就不是洗涤了。后续用Ni-IDA柱不可以加，用Ni-NTA柱少加。
0-1%beta-ME:同DTT,还原能力稍弱。气味那个香啊……
0-2N Urea:变性剂，有利于包涵体中氢键、疏水键、范德华力……的打开，有利于洗涤去除杂蛋白。同样高浓度会使包涵体溶解。类似的是盐酸胍，更强的变性剂，更高的价格，我等不穷的人也消费不起。当然，你很富就用吧，有时候更有利于包涵体蛋白的线性化。
0.05-1%Triton X100:非离子型表面活性剂，像洗衣粉一样用了。同样的还有zwittergent,一种我一直想找机会试试的东东，当年为了溶解beta干扰素包涵体搞得我好苦。
0-2mM EDTA:螯合剂，去除金属离子，有利于蛋白的稳定和溶解。Ni柱禁用。
其它：期待各路英豪奉献。
（2）包涵体溶解
看了包涵体洗涤部分，怎么溶解包涵体应该心中有数了。无非就是pH,变性剂，还原剂，表面活性剂等等的组合。经典的包涵体溶解液的配方为：pH8.0,20mM Tris,8M Urea.说它经典，是因为我用的最多，嘻嘻。再根据个性蛋白纯化的需要往这个配方里面加调料，如Ni柱纯化的咪唑、氯化钠；溶解或吸附不好时再加点DTT、Triton.
包涵体的溶解也有两个小Trick,独门秘籍哦。第一，包涵体沉淀在溶解时往往会有一些像硬胶状的块块，有弹性，很难溶。你可以在加变性剂之前，加一点buffer进去，用玻璃棒或硬塑料棒搅成面糊糊，尽量不要有大块块。然后再加变性剂磁力搅拌溶解，要溶解迅速得多哦。第二，可以借助超声来溶解。像超声破菌一样操作，超声次数30-50次。超声不仅仅是有利于包涵体溶解，还有一个功效就是打断核酸，降低粘度。这对离心和过滤很重要，很重要。我们在溶解包涵体后往往离心倾倒上清时，溶液很粘，一不小心底部的沉淀就跟出来了；还有过滤时滤不动。这都是没有超声的原因。
六、纯化方法
领袖说过：不管黑猫白猫，抓到老鼠就是好猫。对纯化来讲，能拿到纯度好的蛋白，符合你纯化的要求就是硬道理。纯化方法不好讲，各种蛋白不一样，纯化工艺自然不同；即使相同的原料也有不同的纯化方案。纯化的方法我们有层析、沉淀、萃取、透析、超滤等等。
柱层析是纯化最强有力的手段，几乎每种蛋白的纯化都会用到层析。各种层析方法：如亲和、离子交换、疏水、反相、分子筛等等都是我们工艺宝库里的吃饭家伙。不知道怎么吃啊，没办法了，你还是先去补一补基础知识吧。GE公司的一套书个人认为是最佳的入门资料，如Recombinant Protein Purification,Affinity Chromatography,Ion-Exchange chromatography,Gel Filtration,等等，在GE的网站上应该能下载到，或者干脆打个电话给GE的销售员或技术支持，请他给你一个光盘就什么都有了。
在做纯化之前，我们需要知道一些待纯化蛋白的信息。如蛋白质序列，载体类型，理论等电点，理论分子量，疏水性等等，这些都是computer paper work,电脑上查查就有了。如果还能查到一些与目标蛋白纯化相关的文献也不错，不过没有也没关系。我是较少查文献的，奉行的原则是：与其看不如自己做，看了也难以做出来，做不出来了再去看。我就是一个工匠，操作工，而不是做科学的哦。这也是我对纯化的看法，好听一点的就是实践的科学，哈哈。
查文献的目的不在于copy它的纯化工艺，这是新手最最常犯的毛病，以为copy文献就能完成纯化工艺了。要知道文献的真实性是有一点折扣的，作者的原料和纯化的目的与你也不相同。查文献的主要目的在于了解你要纯化的蛋白的性质，它的一些检测方法，特别是有关于活性的检测方法。
怎么讲这一节呢？各种纯化的原理我就不讲了，也不可能有瑞典老兄书上讲得好（GE层析的根在瑞典的uppsala），还是举例来说明吧，做一些简单的分析。讲两个实例，一个是可溶表达的蛋白，一个是不可溶表达的蛋白。
（一）、可溶表达的蛋白A
1、computer paper work:
大肠杆菌BL21,pET32a载体融合表达，N端融合Trx（硫氧还蛋白109aa）和his6-tag（共49aa），DDDDK肠激酶位点后为需要的目标蛋白A,融合蛋白的分子量为21.2kd,Trx（DDDDK前）的分子量为17.1kd,蛋白A的分子量为4.1kd,蛋白A稳定性好，水溶性好，融合蛋白的理论等电点为5.9,Trx（DDDDK前158aa）的理论等电点为5.4,蛋白A的理论等电点为9.7.
2、纯化要求
符合重组药用蛋白要求，SDS-PAGE纯度大于95%,HPLC纯度大于95%,Western Blott单一条带，去除内毒素。
3、纯化设计分析
此为一典型的小分子蛋白融合表达实例。
由于有his6-tag融合可溶表达，可以采用Ni柱来进行初步纯化。
融合蛋白的理论等电点为5.9,可以考虑用Q柱、DEAE柱来吸附纯化。
融合蛋白需要酶切去除融合片断，要做肠激酶酶切工艺。
蛋白A的理论等电点为9.7,可以考虑用SP柱来吸附纯化。
酶切后的蛋白纯化可利用his-tag和pI的差异。
目标蛋白的分子量较小，有可能试一试反相纯化。
纯化样品要求去除内毒素，可以用Q柱、DEAE柱来吸附内毒素。
编辑: ludongcn 作者:skykiller
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