蛋白质纯化武器—工艺篇
4、纯化流程
（1）破菌离心：
采用pH8.0,20mM PB,0.5N NaCl缓冲液超声破菌，离心上清过滤后，量体积，加咪唑至55mM,调节pH为8.0.
点评：破菌缓冲液先不加咪唑，是为了更精确的保证咪唑的浓度，因为破菌过程中，菌体内液体的释放会稀释咪唑浓度。
同理，上柱前的样品要调节pH,因为破菌会使样品的pH下降，细心的话，检测一下，可见pH会从8.0下降到7.7-7.8左右。
55mM咪唑浓度是经过了分段洗脱优化的结果，最大程度地保证目标蛋白吸附，而杂蛋白穿透。做优化时，起始的咪唑浓度一般选择10-20mM咪唑，5-10mM分段加上去。
（2）Chelating Sepharose FF柱纯化：
pH8.0,20mM PB,0.5N NaCl,55mM咪唑缓冲液平衡后上样；相同缓冲液淋洗完全至基线；150mM咪唑，pH8.0,20mM PB,0.5N NaCl洗脱融合蛋白；250mM咪唑，pH8.0,20mM PB,0.5N NaCl洗脱杂蛋白。
点评：Chelating Sepharose FF填料是Ni-IDA类型的介质，最大的好处就是可以反复再生使用，特别是脱镍后用NaOH洗柱可以有效地去除内毒素，彻底将填料清洗干净。
150mM咪唑洗脱融合蛋白也是前期分段洗脱优化的结果，综合考虑了纯度和收率以及收样体积的因素。更低的咪唑浓度，如100-120mM咪唑也可将融合蛋白洗脱下来，但是洗脱峰很拖尾，纯度虽然好一些，可收样体积要大许多，收率也略低。
250mM咪唑洗脱杂蛋白不是此工艺中的要点。实际上，我们在操作过程中往往没有此步骤，就直接用EDTA将柱脱镍再生了。
镍柱在上样后的缓冲液淋洗阶段，峰往往很拖尾，要耐得住性子，让它淋洗完全。
此柱的融合蛋白载量大约为20mg/ml.不同的镍柱，不同的蛋白，载量也是不同的。
经过一步Chelating Sepharose FF纯化，融合蛋白的SDS-PAGE纯度大约为90%.
（3）Sephadex G-25（fine）换液
pH8.0,20mM PB做缓冲液置换。更换Chelating柱洗脱融合蛋白的溶液体系，使得适合肠激酶酶切的要求。
点评：Sephadex G-25（fine）的上样量大约为柱体积的30-35%,有轻微的纯化作用，有时候可以去除一些电泳上看不到的小分子杂质。
在酶切之前，本例也做过Q柱吸附纯化融合蛋白试验，吸附没问题，也能做到进一步的纯化。只是后来在工艺整合过程中发现此步不是必需的，就省略掉了。
（4）肠激酶酶切
酵母表达的重组牛肠激酶，酶切用量每16mg融合蛋白用肠激酶1个单位，酶切体系为pH8.0,20mM PB,酶切温度35-37℃，酶切时间16小时。
点评：商品化的肠激酶有多种，有生化提取的，有重组大肠杆菌的，还有就是重组酵母表达的，其中以重组酵母表达的肠激酶活性最高。
此处的肠激酶活性单位为Invitrogen公司产品标准，定义可以参考Invitrogen公司的EKMax manual,不过Invitrogen公司的推荐参考量太低了，它的标准是1个单位20ug融合蛋白，哈哈。
Invitrogen公司的标准酶切体系是50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl2, and 0.1% Tween-20.本例中没有加CaCl2和Tween-20,试验表明无明显影响。如果你的融合蛋白不好切，可以考虑增加这两项。
此处的酶切用量标准由酶切梯度试验获得。即固定融合蛋白量，加入不同单位的肠激酶，SDS-PAGE比较酶切效果。取融合蛋白酶切约80-90%的量。可能有人会问，为什么不是95-100%?做过酶切梯度的就会知道，这个10%量的增加是以酶量成几倍增加才能实现，而且酶量越大，非特异性切割的可能性就越大。
酶切时间取16小时是因为下班前加好酶，第二天上班时正好是16个小时，符合我等工作节奏哦。
酶切可置于恒温摇床上进行，转速开得缓慢点。小量酶切就放在恒温培养箱中。
（5）Q Sepharose FF柱纯化
pH8.0,20mM PB平衡Q柱，上样酶切后样品，目标蛋白穿透，未酶切的融合蛋白和Trx-histag吸附于柱上。
点评：此步纯化很简单，仅仅是个流穿纯化，但效果非常好。Q柱不仅去除了绝大部分的杂蛋白，而且还去除了内毒素和酶切时加入的肠激酶。
Q柱在平衡前要用0.5N的NaOH洗柱以去除内毒素，平衡缓冲液要用注射用水配制且通过3kd的超滤膜来去除缓冲液中的内毒素。
样品在上Q柱前，要进行过滤操作。酶切过程中会有少量的沉淀产生，可能是因为我没有往酶切体系中加0.1% Tween-20.药用蛋白不敢随便加表面活性剂，否则要在QC中验证工艺可以完全去除。酶切加入的肠激酶就必须做去除的QC验证，这是后话了。
Q/DEAE类型的阴离子交换柱是纯化中应用最广泛的操作。因为大部分蛋白质的等电点在中性或偏酸性，阴离子交换柱可以吸附纯化。换而言之，如果你的目标蛋白等电点比较高，那么恭喜你了，纯化要方便多了。还不明白？你的目标蛋白与众不同啊，就像本例中的蛋白A,用Q柱可以高效的穿透纯化。
酶切后经过Q柱纯化，蛋白A的SDS-PAGE纯度可以达到95%以上，基本上看不到明显的杂带。但做反相HPLC检测，纯度只有85%左右。由于两种检测方法的原理不同，样品中可能含有一些小分子的杂质，电泳检测不到，而反相HPLC可以检出。还有一个可能，就是酶切毕竟是个蛋白酶的水解过程，特异性再好也有错切的时候。也许有少量的蛋白A被多降解了几个氨基酸。另外就是目标蛋白质本身可能有高级结构方面的差异。回想起来，那可是一段沮丧的日子。革命尚未成功，同志仍需努力。
编辑: ludongcn 作者:skykiller
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
|
