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1. 灵敏度/检测限（detection limit）
“灵敏度”最初是一个统计学概念，表示样本中检测结果阳性数占所有阳性样品的比例。扩展到各个领域当中就成为各种机器或方法的性能指标，灵敏度越高，越能反应测定值的实际情况。在Western Blot试验中，如果要量化抗体检测的灵敏度就需要一个参数——抗体检测限（detection limit）。
2.抗体浓度
抗体浓度对于商品化抗体的影响有两方面。首先，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较；另外，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，然而相同质量下，低浓度的抗体体积更大所以，计算抗体性价比的时候应该考虑的因素是抗体的质量而非体积。
蛋白定量
蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因
1. 双缩脲法：
双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是 Cu2+ 与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在 540nm 波长处有最大吸收。双缩脲法常用于 0.5g /L ～ 10g /L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如 Tris 、 Good 缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积 10% 冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的 1m NaOH 溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
2.Lowry 法：
此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即 Cu++ 与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷 - 磷钨酸试剂（福林 - 酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定 20mg/L ～ 400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性 pH 环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在 pH10 时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的 Cu2+- 蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸 - 磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被 Cu2+- 蛋白质络合物所还原。
3. 紫外吸收法：
大多数蛋白质在 280nm 波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在 280nm 处的吸收可用于测定 0.1 ～ 0.5mg/ml 含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在 260nm 波长处有最大吸收。
4. Bradford 比色法：
Bradford 比色法比 Lowry 法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸 / 三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、 2- 巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、 Tris 和一些碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加入 0.5mg/ml 牛血清白蛋白（ 5 ， 10 ， 15 和 20µl ），以 0.15mmol/l NaCl 补足至 100µl ，同时以两管 100µl 的 0.15mmol/l NaCl 作空白对照。每管各加入 1ml 考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置 2 分钟。用 1cm 光径的微量比色杯测 A595 ，取 A595 吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的 A595 。从 BSA 标准曲线中确定待测样品的浓度。测定 10-100µg 的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大 5 倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在 10-100µg 另作一标准曲线进行测定。
5 ．电泳估算法：
样品倍比稀释， SDS-PAGE 电泳，同时做定量 marker 对照，可以估算样品大概浓度。
以提取癌组织总蛋白为例：
① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用 dH2O 漂洗 5 ～ 10 次，再用预冷的 1×PBS 洗涤 3 次，目的是去除样本中的血液。
② 每 2 克 组织加入 3ml 1×PBS 匀浆，保持在 4 ℃ 条件进行。
③ 加入 5×STOP Buffer 缓冲液 1ml ，混匀， 4 ℃ 下超声碎化。再加入 0.5ml β-ME ， 0.5ml 溴酚蓝，煮沸 10mins ，至此，制样过程完成；
④ SDS-PAGE 电泳，以 BAS 作为对照估计样品蛋白浓度。
编辑: helen
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