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1. 灵敏度/检测限（detection limit）
“灵敏度”最初是一个统计学概念，表示样本中检测结果阳性数占所有阳性样品的比例。扩展到各个领域当中就成为各种机器或方法的性能指标，灵敏度越高，越能反应测定值的实际情况。在Western Blot试验中，如果要量化抗体检测的灵敏度就需要一个参数——抗体检测限（detection limit）。
2.抗体浓度
抗体浓度对于商品化抗体的影响有两方面。首先，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较；另外，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，然而相同质量下，低浓度的抗体体积更大所以，计算抗体性价比的时候应该考虑的因素是抗体的质量而非体积。
Western Blot常用试剂
1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用 Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS- PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、 转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、 丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸 30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、 脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、 过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
编辑: helen
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