你知道吗？ 详细 >>
1. 灵敏度/检测限（detection limit）
“灵敏度”最初是一个统计学概念，表示样本中检测结果阳性数占所有阳性样品的比例。扩展到各个领域当中就成为各种机器或方法的性能指标，灵敏度越高，越能反应测定值的实际情况。在Western Blot试验中，如果要量化抗体检测的灵敏度就需要一个参数——抗体检测限（detection limit）。
2.抗体浓度
抗体浓度对于商品化抗体的影响有两方面。首先，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较；另外，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，然而相同质量下，低浓度的抗体体积更大所以，计算抗体性价比的时候应该考虑的因素是抗体的质量而非体积。
SDS-PAGE实验操作
试剂：
1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/l的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/l HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/l HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液。
6. 10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）。
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
SDS-PAGE凝胶的有效分离范围
丙烯酰胺浓度（%） 15 12.5 10 7.5 5.0
线性分离范围 15-435kDa 15-60kDa 18-75kDa 30-120 kDa 60-212 kDa
器材
电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
样品制备
将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20μl＋5μl）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样。
电泳
1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；
3. 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；
ddH2O 3.0 ml
1.0 mol/l Tris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30% Acr-Bis 2.8 ml
10% SDS 80 μl
10%AP 56 μl
TEMED 6 μl
4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5. 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH2O 1.0 mol/l Tris-HClpH=6.8 30%
将上层重蒸水倾去Acr-Bis
2.0 ml 400 μl 600 μl
10% SDS 10% AP TEMED
36μl 24μl 4μl
6. 滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;
编辑: helen
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
