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1. 灵敏度/检测限（detection limit）
“灵敏度”最初是一个统计学概念，表示样本中检测结果阳性数占所有阳性样品的比例。扩展到各个领域当中就成为各种机器或方法的性能指标，灵敏度越高，越能反应测定值的实际情况。在Western Blot试验中，如果要量化抗体检测的灵敏度就需要一个参数——抗体检测限（detection limit）。
2.抗体浓度
抗体浓度对于商品化抗体的影响有两方面。首先，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较；另外，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，然而相同质量下，低浓度的抗体体积更大所以，计算抗体性价比的时候应该考虑的因素是抗体的质量而非体积。
Native-PAGE常见问题分析
1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗？电泳1－2小时再加结合反应产物吗？
预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一般３０－６０分钟后加样电泳。
2. 银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？
步骤是：
（1） 固定：10%冰乙酸30min。
（2） 清洗：双蒸水冲洗凝胶2次，每次1min。
（3） 染色：染色液（1g硝酸银，1.5ml 37%甲醛，1l 双蒸水。现配）染色30min。
（4） 清洗：迅速洗凝胶1次。
（5） 显影：30g碳酸钠，1.5ml 37%甲醛，200μl 10mg/l 硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。
成功银染的关键因素包括：
（1） 用超纯水（比如，NANOpure或Milli-Q纯化）或者是双蒸水作银染。
（2） 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。
（3） 在染色后，水清洗所用时间的长短很重要，用不超过5-10秒的时间清洗胶，然后放入显色溶液中，一般在水里浸一下就好。
（4） 甲醛和硫代硫酸钠（400μl/1ml）在使用前，及时加入到显色液中。
（5） 在使用前及时配染色液。
3. 变性PAGE的上样缓冲液配方？如何准备上样的蛋白？是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有SDS,不知有没有用于非变性PAGE的裂解液.具有操作步骤是什么?
非变性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上样缓冲液可以用普通的loading buffer，含有Tris,溴芬兰以及甘油即可，甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己配。细胞超声即可，超声后离心取上清.也有配NATIVE-PAGE gel所用buffer为1*TBE,用的running buffer也是1*TBE。还有一点就是要在配gel时考虑能使蛋白多聚体稳定的因素。
4. 做了naive---PAGE没有条带，蛋白质是纯品，分子量很大，怎么回事呢？
因为分子量很大，8%的胶浓度较合适。加样时加个marker，可以检测胶制备是否有问题。银染方法比较灵敏，如果蛋白是一种酶，且可使某种底物显色的话，可以用活性染色试试，更灵敏。
编辑: helen
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