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1. 灵敏度/检测限（detection limit）
“灵敏度”最初是一个统计学概念，表示样本中检测结果阳性数占所有阳性样品的比例。扩展到各个领域当中就成为各种机器或方法的性能指标，灵敏度越高，越能反应测定值的实际情况。在Western Blot试验中，如果要量化抗体检测的灵敏度就需要一个参数——抗体检测限（detection limit）。
2.抗体浓度
抗体浓度对于商品化抗体的影响有两方面。首先，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较；另外，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，然而相同质量下，低浓度的抗体体积更大所以，计算抗体性价比的时候应该考虑的因素是抗体的质量而非体积。
HRP显色
显色（HRP酶）
1．增强化学发光法(ECL)
Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：
鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。
试验步骤：
1）将两种显色底物1：1等体积混合（一般各1ml/membrane）。
2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。
3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。
4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。
5）显影、定影。
6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。
注意：荧光在一段时间后会越来越弱。
2.DAB显色
DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。
对于AP标记的二抗我们选用BCIP and NBT 显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。
Western显色
ECL灵敏度比DAB高不少
编辑: helen
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