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1. 灵敏度/检测限（detection limit）
“灵敏度”最初是一个统计学概念，表示样本中检测结果阳性数占所有阳性样品的比例。扩展到各个领域当中就成为各种机器或方法的性能指标，灵敏度越高，越能反应测定值的实际情况。在Western Blot试验中，如果要量化抗体检测的灵敏度就需要一个参数——抗体检测限（detection limit）。
2.抗体浓度
抗体浓度对于商品化抗体的影响有两方面。首先，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较；另外，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，然而相同质量下，低浓度的抗体体积更大所以，计算抗体性价比的时候应该考虑的因素是抗体的质量而非体积。
显影--淬灭的祸因
当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，目前国内一些实验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规的底片显影都省略了，因此以下所讨论的某些细节问题可能不再出现。
首先坛子上还有少数实验室处于DAB显色时代，奉劝一句，都走到最后一步了就不要节省了；DAB显色的灵敏性是远远不够的。目前较为流行的仍是化学发光法，下面简述一下其原理：
交联在二抗上的HRP酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL中主要包含两种成分，催化剂和中间递质（白色瓶子主要是过氧化物如双氧水）。催化剂的作用不用废话了，其中间递质主要是吸收化学能并将其传递到luminol之类的化合物上产生电子跃迁从而激发荧光。因此催化剂的效率和中间递质的传递效率直接影响荧光的强弱。本人曾自制过ECL并尝试改良，其间发现很多化合物、金属离子如Fe、Cu等能催化并高效传递能量，且不依赖于HRP浓度，荧光信号能瞬间曝强；这其实与下文提到的一些粹灭原因有联系。
当初我自制的ECL最大的毛病在于稳定性不好，同理，商品化的ECL同样也有保质期的问题，往往最先失效的组分就是过氧化物，尽管他们必然添加过抗还原剂。其实，检验ECL是否失效的方法很简单，取稀释的即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中观察荧光强度，即可知道ECL是否失效。
商品化的ECL价格并不便宜，因此ECL孵育的最佳方案是：将ECL滴加在保鲜膜上或干净的支持物上，如废弃的旧底片、塑料盒，有机玻璃盒等等（注意，国产的保鲜膜很多质量不过关，有两种潜在的问题，下面详述），然后倒扣膜于保鲜膜上，夹住一个角来回拖动数次至ECL均匀（有的产品说明书要求孵育1min）。另外平铺一张干净的保鲜膜，将膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后显影。mini3型胶整张膜孵育，ECL总体积0.7-1ml足矣。
哪些因素会影响荧光信号的强弱呢？（这部分实际上与导致荧光淬灭的因素部分重合）
1.保鲜膜的质量。
a.国产的保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。ECL滴加到保鲜膜上容易从肉眼不易分辩的小孔泄露，一方面ECL反应不充分，另一方面ECL所含液体会溶解试验台上残留未知的化学药品颗粒（也许你或其他人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短的时间内消耗掉所有的HRP酶，荧光转瞬即逝。
b. 保鲜膜的化工原料或拉制过程中，残留未知的化学试剂，引起荧光淬灭；廉价的保鲜膜问题尤多。
目前，国产的就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。
如果买不到合格的保鲜膜，也可以用其他物品替代；但要特别注意这些支持物表面的干净，最好不要有任何化学试剂残留，包括风干的TBST盐结晶颗粒。
2.ECL孵育结束后膜需要控干。中学物理学过水会吸收光谱，因此任何液体包括ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。一般夹起膜，让膜的一角或一边接触吸水纸；但是请注意不能让膜完全干掉。某些信号较弱的ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；较好的试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标记新抗体时的背景。因此，按照我的方法，让自由流下的多余的ECL被吸走就好。
3.控干的膜要仔细用保鲜膜包被，防止接触外界异物造成荧光淬灭；同时，包裹保鲜膜时要细心，尽量不让正面保鲜膜和膜之间出现皱褶。皱褶的地方会堆积多余的ECL，要么形成一条荧光的亮线；要么由于液体吸收荧光或者局部区域HRP过度消耗，呈线条状淬灭。
4.在膜放入压片夹之前，最好肉眼观察一下荧光信号的强弱，这有利于判断实验可能出现的问题。很多人提问看见很强的荧光了，但怎么压片都没有信号，那么就是快速淬灭（闪灭，再怎么快速操作也拿不到这种情况下的荧光信号）造成的；有这个观察至少能够判断ECL孵育之前实验操作应该问题不大，而问题主要是淬灭。如果你省略这个步骤，那问题就非常复杂了，因为之前任何操作都可能导致白板，根本无法判断。
除上述的问题以外，还有哪些因素会导致荧光淬灭呢？
1. 抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。在电泳的章节就曾提过，如果上样量太大，不仅条带会粘连、弯曲，更可能导致淬灭。因为局部区域过多的HRP酶会快速消耗底物呈富氧态，条带出现烧灼样（取出膜会发现一条明显的暗黄色的带），荧光信号会闪灭或者条带空心（条带灰黑不实，则可能是显影液接近失效）。
2. 抗原浓度太低，荧光信号太弱，相对慢一点的淬灭。可能第一次压片能够获得很弱的条带，随后都不可见。
3. ECL试剂质量。除过氧化物因接触空气被逐渐还原外，ECL的成分通常都不稳定。如呈递电子跃迁能的中间递质其化学性质就不太稳定，因为它转换能量的特性决定其必是一个有中间态的化合物，长期接触空气会被逐渐氧化失效；luminol也有保质期。
4. 操作时间过长，膜逐渐彻底干掉。商品化的ECL会出现波形渐变，开始信号逐渐增强，背景一起升高；随后荧光完全衰减淬灭。
5.不良的实验习惯。坛子上曾经有人问及淬灭问题，提到显影夹子很脏。脏的显影夹主要有两种污染，铁锈和不慎沾染的显影液、定影液，前者造成闪灭（催化作用），后者可能直接导致无荧光；只要有任何失误，诸如不小心刮破保鲜膜，保鲜膜包裹不严实（其实通常还真的不严实，因为你不可能包裹好几层）。于是，我问他用一个很脏的东西不觉得很别扭嘛，为什么不先抄起抹布擦干净再用呢。
6.淬灭的假象。少量沾在膜表面的二抗也会激发荧光，但ECL孵育时稍微晃动就消失了，可能产生淬灭的错觉。
编辑: helen
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