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1. 灵敏度/检测限（detection limit）
“灵敏度”最初是一个统计学概念，表示样本中检测结果阳性数占所有阳性样品的比例。扩展到各个领域当中就成为各种机器或方法的性能指标，灵敏度越高，越能反应测定值的实际情况。在Western Blot试验中，如果要量化抗体检测的灵敏度就需要一个参数——抗体检测限（detection limit）。
2.抗体浓度
抗体浓度对于商品化抗体的影响有两方面。首先，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定，受生产工艺和成本控制等因素影响，不同品牌的抗体的浓度也不相同，所以购买时应注意比较；另外，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，然而相同质量下，低浓度的抗体体积更大所以，计算抗体性价比的时候应该考虑的因素是抗体的质量而非体积。
Western Blot转膜
在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。
A 半干法
即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。
1 实验条件的选择
电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。
目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间
80---140 8% 1.5-2.0
25---80 10 1.5
15--40 12 0.75
<20 15 0.5
2 实验操作
（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。
A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。
B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。
C. 将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。
D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。
PDVF膜在进转移缓冲液时，要在甲醇里面泡多长时间?
PVDF是疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润。 PVDF的预处理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后转入蒸馏水洗两次。用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。
一般5-20分钟都有人在用。可在取胶的同时泡，估计前后5分钟左右。效果还不错。以前有站友发贴，说处理时间没多大关系，关键看膜的质量．确实是这样的。只要让膜完全浸透应该就没问题了。
Hybond的PVDF说明书这样的写的：“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是，至少10秒钟，多泡下也没关系的，事实上，泡10秒的做过，10分钟的也做过，都没有问题的。
（2）转移
A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。
B. 将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。
C. 将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。
D. 剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。
E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。
F. 装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。
G. 转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。
3 注意事项及常遇到的问题：
1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶。
2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。
3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。
4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。
5）转移时间一般为1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。
1)在叠膜、胶、纸三明治时候，操作于盛有转膜Buffer的大平皿中进行，叠好后，再将三者平行转移至转膜装置，切勿再移动，因为在buffer中操作，已经完全排除了气泡存在的可能，无需再赶气泡
2)关于转膜时间：半干转的话，20 V×30min即可
B 湿法
我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。
C 转移后效果的鉴定
1．染胶
用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。
2．染膜
有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。
编辑: helen
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