核酸抽提的基础(二)
E 后续酶反应失败
资料书中连篇累牍的原因我就不说了，因为都对。我相信因为大家首先相信的就是它们，所以碰到问题首先一定会从那些方面着手。如果三次实验后，问题还没有解决，那么 90% 的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀，可以陆续“杀”死很多酶；大分子物如蛋白质，像绳子，只能“捆住”一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。
F 蛋白质是如何残留的
PC 纯化：a-取上清时取到中间层及下层；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。
高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 （可以使用低温沉淀加以改善）。
介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。
G 小分子物质 （苯酚、盐） 是如何残留的
醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。
介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。
10、某些我使用的操作手法
实验做多了，的确希望能偷点懒；偷懒也有讲究，否则就是偷鸡不成失把米。下面就是一些在确保抽提成功前提下的通用操作方法；有些看起来很麻烦，但请想一想抽提失败后的再次抽提，应该是可以算偷懒的方法了：
I：混匀操作 （1.5ml 离心管内） – 如果液体体积在 100ul 以内，用指头弹击尖底混匀；在100-400ul 之间，用振荡器混匀；大于400ul，用手晃动混匀：晃动时使离心管底永远处于斜上位置，频率要快。
II：PC 抽提时上清的移取 – 离心管倾斜，根据上清的量选择不超过 200ul 的移液器，在外面先压下移液器，再将 tip 移入上清。Tip 要尽可能靠近液面，tip 的尖嘴接触内壁，缓缓松手吸取上清。可多次移取，但决不要使用 1ml 移液器。
III：核酸的洗涤 – 核酸沉淀后离心，将上清倒掉。如果核酸是来源于杂质比较多的样品 （如植物、动物肝脏、细菌等），则在加入 75% 乙醇之前，再将离心管短暂离心后，用移液器将残留液体彻底吸出，否则，75% 的乙醇非常容易将残留液体中的多糖等杂质给沉淀下来。移取 75% 乙醇使用一次性的塑料吸管，加入后将核酸彻底悬浮起来，置于室温一段时间 （时间长短取决于沉淀大小），期间多混匀几次。如果去除 75% 乙醇的操作是“离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体”，则洗涤 2 次；如果去除 75% 乙醇的操作是“离心后倒掉”，则洗涤 3 次，但最后一次仍然采用“离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体”。这样洗涤的目的，是确保小分子物的残留低于 10 万分之一 （最大残留不高于 10uM 级）。
11、一些特别的问题
a：EP 管的问题
几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象 （如核酸在 -20C 保存一天后发生了降解） 有关系，但事实是，EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。
硅化可以提供最高质量的 EP 管，使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的，因为便宜；而正因为便宜，其材料总是不令人放心的。
编辑: ludongcn 作者:上海孤儿
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