核酸抽提的基础(二)
我个人认为，只有硅化过的 EP 管，才可能按照标准操作获得满意的结果。否则，某些操作步骤必须调整，才可以获得稳定的质量。
b：核酸抽提中的温度问题
核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用室温是最好的选择。那些认为“低温操作可以防止或者减少降解”之类的理由，并没有多少可操作性的。低温的确可以减低酶的活性，但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度，此消彼长，没有办法给出结论的。就 RNA 抽提而言，彻底匀浆前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的风险，彻底匀浆后的温度对 RNA 的完整性影响已经不会大的；如果发现影响很大，说明 RNase 没有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更没有道理的是认为低温沉淀和低温洗涤可以防止降解了。事实上，核酸一旦被沉淀下来，对酶的耐受力是很强的，这就是核酸保存在醇溶液中最稳定的理论基础。如果说沉淀使用低温还可以提高得率，洗涤使用低温又是为什么？彻底的错误而已。
c：如何阅读操作手册
拿到操作手册后，要倒着阅读：先阅读问题解答，再看操作步骤下面的说明，再看操作步骤。问题解答是别人在使用过程中曾经碰到过的问题集锦，操作步骤下面的说明是商家的警告。没有一个商家会将他的操作步骤写得非常复杂，因为这是满足使用人员习惯的结果。一句话，PS 和 By the Way 之类的话中含有真正的有用素材。
12、延伸的思考
a：标准化的概念
所谓的标准化，指的是一套程序，确保不同的人能获得质量接近的产物的程序。标准化并不是以获得最高质量为目标，而是以稳定为目标。标准化的核心是质控。
事实上，核酸抽提的每一步操作，都有一个核心；重要的是找到可观察的指标或者现象作为参考，从而确保实验的成功。如悬浮的核心是没有块状物的存在，彻底消化的核心是没有块状物的存在，PC 抽提的核心是混匀-两相成为乳状，取上清的核心是用小一点的移液器移取液体，吸取时 Tip 的尖头尽可能接近液面，吸取速度要慢，并且要留下 1mm 以上的液体不要再吸。去上清的核心是先倒空，再短暂离心将残留液体离到管低，用移液器彻底移出。洗涤的核心是彻底悬浮沉淀，并且要放置一段时间 （时间长短与沉淀大小有关） 使沉淀内部也能被洗涤到。按这样的方法抽提的核酸，其质量是非常稳定的。
柱离心式实际上就是非常标准化的核酸沉淀与洗涤的操作。一般而言，如果严格按照操作步骤去做了，柱式操作出问题，系统性的与试剂盒有关，偶然性的与操作有关。这一点，应该是可以理解的。
一个方法，其标准化程度越高，其稳定性就越好。步骤越少，标准化就越容易。产品的开发也要以高标准化程度为目标。
b：QC 的概念
QC （质控） 概念远没有 QT （质检） 概念深入人心。最高境界的产品追求的是免检，或者是 Trouble-free。另外，现在的许多产品也是不允许 QT 的 （因为是一次性的），因此就只能靠 QC 来保证质量了。QC 是将精力集中在过程中：原料、操作等。只要严格按照标准去做，最终的结果就有保证。事实上，很多实验人员是不做检测而直接将抽提好的核酸用于后续实验的；他们之所以可以这么做，是因为他们有意无意之中非常的注意 QC。也有不少人，尤其是新手，Pay no attention to QC，只知道最后的 QT。一旦发现问题，就去逆推原因；但因为过程中所出现的现象根本就没有注意，几乎不可能准确找出真正的原因的。如果 QC 做得好，最后的 QT 是否全部做/部分做/完全不做，取决于时间、经验、后续实验的成本等因素。
c：其它
核酸抽提的每一步操作，都是利弊权衡的结果。消化要彻底，时间就会长；PC 抽提时多取上清，得率会提高，但增加了蛋白质污染的风险；沉淀使用低温且延长时间，得率会提高，但增加了杂质污染的风险 … 不足详列。总之，核酸抽提是艺术，可以根据自己的样品及当时的情况，对操作步骤进行适当的优化。
d：实验的思维
核酸抽提的成功，就是每一步都没有失败。这不是玩文字游戏，而是告诉你做实验的良好思维。就如同小学基础没有打好，早晚会发现大问题一样，做实验决不要以成功为喜悦，以失败为痛苦。要保证实验成功，绝对不能有“这个操作应该没有问题”，“用这个可能不会有问题”之类的侥幸心理。去掉任何一个可能使实验失败的因素，这才是实验该有的出发点。用这样的出发点，实验几乎没有不成功的，所以说，实验成功没有什么快乐；实验的快乐来自于：发现自认为不会导致失败的某因素实际会导致实验的失败。学到了这样的知识，才有快乐的理由。
编辑: ludongcn 作者:上海孤儿
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
