核酸抽提的基础(二)
半年前我开始考虑这样的裂解液时，只是抱作玩的态度。失败后思考，思考后再失败；半年下来，试剂的配制进展有一点，但“发现”的用途却越来越多：所有原来采用苯酚抽提去除蛋白质的纯化操作，如酶切后的纯化、 DNase 降解 DNA 后的纯化 … 都可以用这样的裂解液来替代。其前景越来越美好，内心却越来越不平和，患得患失起来；开放这个思路，我就会不那么在意了。这个裂解液应该是有比较好的经济价值的 – 即使是技术的卖价应该也不会低于 6 位数；任何人都可以用玩的心态试一试，不过不要赌博就是。
h：醇沉淀的语言 Flash – 从低浓度核酸沉淀条件的改变看核酸是如何形成沉淀的
核酸醇沉淀的原理，按照分子克隆中的描述，是用阳离子中和了磷酸根的负电荷后，核酸“无性”结合才能沉淀下来。低浓度核酸沉淀的条件一般要做如下改变：使用长时间的低温、使用更高比例的醇、使用 tRNA 之类的东西。下面就用 Flash 语言的特点，描述一下“无性”的核酸是如何结合的。
溶液中的单个核酸，虽然是“无性”的，对其它的核酸，仍然是有引力的 （大小与距离相关）；同时，核酸分子受到的另外一个力，来自分子运动。在一般情况下，核酸之间的引力比分子运动产生的力小许多；只有当核酸之间的距离足够近时，引力才能克服分子运动产生的力，使两个核酸结合到一起。结合在一起的两个核酸又共同对其它的核酸产生引力 （该引力比单个核酸的要大），结合上更多的核酸 … 最终沉淀下来了。低温和更高浓度的醇都有利于降低分子运动产生的力，tRNA 能提高总核酸浓度进而通过与目的核酸的结合提高了目的核酸之间的引力，所以低浓度核酸的沉淀条件如上。至于 2 价镁离子有利于低浓度核酸的沉淀原因，可能是镁离子要被同一核酸分子的两个磷酸根结合，这种结合的结果是核酸分子变得更立体了 （团状）：引力越集中，对外就越大。
i：从柱离心式产品的流行看经典方法的缺点 （或者操作重点）
柱式方法的风行是无法否定的现实。下面通过柱式方法与经典方法的比较，看一看如何注意经典方法的操作重点。
裂解，二者几乎没有任何区别。去蛋白质，柱式靠的是柱材料对蛋白质吸附力低这一特点，将蛋白质残留控制在比较低的水平 （并不是/也不能彻底去除）；经典方法最常用的是 PC 抽提，可以将蛋白质去除得更彻底一些。其它大分子杂质 - 如多糖等 - 的去除，柱式的与蛋白质的去除相似，但经典方法中却没有如此方便的对应方法。小分子物 （盐等） 的去除，在我的眼里，是柱式方法最可爱的地方。如果柱子设计没有问题，离心后柱子中残留的液体稳定而少；柱式的洗涤具有“流水洗涤”的效果；柱式中的核酸是不成团块的 - 这三个特点决定了柱式的洗涤效率比经典的洗涤效率高，所以，柱式纯化的核酸纯度比较高。
结论是：裂解和去蛋白质的能力，经典方法不次于柱式方法；去除其它大分子杂质，经典方法不如柱式；洗涤能力，按目前各种参考书中的介绍去做，几乎没有办法超过柱式方法。你看一看上面柱式方法洗涤的特点，经典洗涤方法哪一条强调了。再想一想你是如何手工洗衣服的，象不象柱式洗涤的特点，就应该不会有疑问的吧。难道过去的核酸沉淀洗涤方法有错误？那倒不是。真正的原因是，过去核酸抽提使用的小分子物 （盐等），多是后续酶反应中会使用到的或者起码少量的残留不会抑制后续酶反应的；现在抽提中使用的东西就不一样了，都是一些对蛋白质有强烈作用的东西，而且浓度还非常高。过去有资料强调测 A230 值吗？自打 Guanidine Thiocyanate 开始广泛用于核酸抽提后，A260/A230 比值的测定成为检测质量标准的一个非常重要的指标了。
如果将洗涤操作更强化及严格一点，对于一般比较干净的样品，你会发现经典方法抽提的核酸完全可以达到非常好的质量的。柱式就还留下一个“快”的特点，当然应该说是“更快”。
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10月1日前不会再补充了，因为现在的头脑状况适合做实验。对于大家的跟帖，我会继续回答。之前的观点，于多数人不会有用，是砖是玉，见仁见智吧；于我自己，还是孤儿好。
节后我会补充一些有实用价值的东西，不过是直接插在相关节内的；为方便查找，会使用带颜色的字体。非常具体的样品的抽提，不会在本帖中提供。我有兴趣整理出一套“孤评核酸抽提操作手册”来，但就象我的兴趣由柱式方法转向经典方法是突然的一样，我也不知道什么时候才会开始整理。不值得期待。
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上次刚说头脑适合做实验，第二天就被通知可能有其它安排。结果是，实验不顺。有一个无心插柳的结果供分享：加入醇沉淀基因组 DNA 时，将沉淀挑到另外一个离心管中，挑不起来的离心使之沉淀；同样洗涤/干燥/溶解后，同时电泳。电泳显示：离心沉淀的加样孔几乎无荧光，20kb 左右有一条亮带；挑出来的加样孔荧光非常强烈，从加样孔到 20kb 之间有弥散带，但没有清晰的主带。
实验不顺，思考的时间就多，所以，原计划节日开始的补充，现在已经补充得差不多了。内容没有删，只有增加和布局上的调整。
抱歉。粘帖过来，发现颜色全部变成黑色了。
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编辑: ludongcn 作者:上海孤儿
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