核酸抽提的基础(二)
e：EB 在 NA 抽提中的运用
EB 在 NA 抽提中的应用，用于电泳，人皆尽知；用于 gDNA 抽提时提高蛋白质与 gDNA 的分离效率，却似乎没有人再考虑了，因为大家都怕使用 EB。在 NA 抽提中涉及到 EB 的另外一大类，就是胶回收操作了；EB 在胶回收中扮演的角色，就不完全是正面的。
如果 NA 与 EB 充分接触，EB 就会以每隔数个碱基的频率均匀地插入 NA 之中。EB 的这种插入，无疑更可能破坏核酸双链的稳定性，使核酸由双链变成单链的压力增加。如果核酸比较短，而错配又多 （错配的后果之一也是核酸容易由双链变成单链），EB 的插入将更容易导致变性的出现。这个观点有如下的实验报告佐证：有相当部分的 PCR 产物胶回收实验，都报告说回收后的电泳结果是：目的条带变淡或者消失，同时出现了一条小的原来不存在的条带。
坛中曾有文描述他做胶回收的程序：两边加 Marker，中间加产物；电泳过程不含 EB。电泳结束后，纵向割下 Marker 条带用 EB 染色后，放回胶原来的位置。开紫外，根据 Marker 的位置割下目的条带，再回收。这是个笨办法，但这样使用的人一定是聪明人。如果这个办法仍然不能消除变性，则只能使用高保真的酶了。
f：蛋白质残留的影响问题 （探讨，没有证据）
一直对蛋白质残留不抱好感，却也没有将它看成威力无比。本节考虑的是蛋白质对酶反应的影响问题，为方便表述，我将残留的蛋白质分成同源的 （与核酸或者酶有同一或者相似的来源，如细菌） 和异源的（与核酸或者酶没有同一或者相似的来源） 两种。
先看异源蛋白质的影响：内切酶几乎都在保存液中添加有 500ug/ml 的 BSA，BSA 是改善 PCR 结果的一个选项，BSA 是稳定低浓度核酸的一个选项。几乎都是正面的。可以看到，异源蛋白质对酶反应没有抑制作用，甚至还有促进作用 （虽然都是以 BSA 为例）。
再看同源蛋白质的影响：AMBION 公司有一个非常有特点的产品 “Cells-to-cDNA Kit”。细胞裂解后不去除蛋白质就直接用于 RT-PCR。该例子应该可以说明，与核酸同源的蛋白质的残留对 RT-PCR 不一定有影响。另外一个例子是质粒的酶切。质粒酶切是比较容易出现一些靠 PC 纯化一次就可以解决的问题的；因为 PC 纯化基本上就是去除蛋白质，所以可以认为质粒抽提中残留的蛋白质对酶切是有巨大影响的。各位看官是否注意到这两个例子的最大区别在什么地方？区别在于残留的蛋白质究竟是与核酸同源还是与蛋白质同源。事实是，质粒抽提中残留的蛋白质是宿主菌的 （Ecoli 或者其它），与质粒并不同源；而内切酶却是来自于 Ecoli 或者其表弟表妹的，与宿主菌的蛋白质同源性是非常高才对。还有一个现象：EcoR I 的 Star Activity 是最明显的，其它来源于 Ecoli 的酶的该活性也不差，这是为什么？
写到这，我头有点痛了，因为我没有办法证明；就是有人提供了证明，我暂时也看不到用途。毕竟，酶反应不是受单一因素影响的。如果说该思考有什么现实意义，那就是：残留蛋白质的危害可能被夸大；许多实验在重复失败，只是因为你抓住的嫌疑犯不是真凶。更大胆的假设是：BSA 可以用于某些核酸抽提，以更彻底去除与酶同源的蛋白质残留。
g：无介质的核酸抽提裂解液 （不含苯酚） 的展望 （供核酸抽提产品生产商及潜在的生产商参考）
经典的醇沉淀和洗涤，在无介质核酸抽提技术中，几乎是不可或缺的，尽管微调可以带来一些意想不到的效果。能展望的，也只有裂解液了。现在的裂解液，都没有同步去除蛋白质的功能；蛋白质的去除，或者靠裂解后再加入苯酚抽提去除蛋白质，或者靠加入高盐溶液去除蛋白质，效果也不错。能做的改进，看起来也就只有配制出这样一种裂解液：裂解效率高 （得率的保证），同时蛋白质可以靠离心去除 （操作简化了）。简单地讲，下面提供的是目前可以想象的结合有高得率、高纯度、操作最简单诸多特点的操作步骤 （以细胞为例。组织捣碎后也适用）：
在样品中加入裂解液，混匀后，静置使裂解彻底。高速离心后，蛋白质沉淀在离心管的底部，上清则为核酸。将上清转移到预先已经加入了醇的离心管中，轻轻混匀后，用一个小钩捞出大的絮状沉淀 （以DNA 为主） 到另外一个离心管中；捞不起来的 （主要是 RNA） 用离心沉底。分别洗涤蛋白质沉淀，DNA 絮状沉淀和 RNA 离心的沉淀，再分别溶解，就可以同步获得 DNA/RNA/蛋白质了。
编辑: ludongcn 作者:上海孤儿
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