2005年12月我国第一部《慢性乙型肝炎防治指南》颁布 ,2006年1月卫生部颁布了《2006-2010年全国乙型病毒性肝炎防治规划》。其目的在于科学、规范和有效开展我国乙型肝炎防治工作。卫生部计划在未来3～4年内逐步建立全国乙型肝炎实验室检测网络,制定《全国乙型肝炎实验室检测工作技术规范》,加强实验室网络人员培训,提高乙型肝炎的实验室诊断水平。以下就目前我国开展的乙型肝炎实验室诊断技术及其质量控制进行简要概述。
乙型肝炎标志物检测
1.方法与原理 乙型肝炎标志物检测目的在于确认患者是否感染乙型肝炎病毒(HBV),是乙肝实验室诊断中最常用的检测方法。目前临床应用的主要方法有:①免疫荧光技术:由于荧光标记的抗原 (或抗体) 受血清成分等本底因素影响过大而应用较少。在此技术上改进的时间分辨免疫荧光法(TRFIA),延长了荧光寿命,降低了本底因素影响,特异性和稳定性都有显著提高,对HBsAg检测下限为0.35～0.5ng/ml。②固相放射免疫法:灵敏度较免疫荧光提高100～1000倍,检测低限达pg水平,但因同位素稳定性差、对环境造成污染等原因也很少用于临床乙型肝炎标志物检测。③酶联免疫吸附试验(ELISA)技术:是目前国内最为常用的乙型肝炎五项检测方法。该方法检测HBsAg灵敏度下限为0.5ng/ml。④微粒子酶免法(MEIA):是近年来新发展起来的一种新的抗原抗体检测技术,该方法对HBsAg检测灵敏度为0.17～0.2ng/ml 。
2.质量控制 卫生部临床检验中心从1988年开始在全国范围内开展乙型肝炎标志物检验的质量评价活动,并制定了临床检验中心室间质量评价方案(EQA)。但实验操作人员的主观性使EQA成绩难以真实反应一个实验室的检测水平。因此有效的室内质控对保证日常检验结果的准确性更有意义。
ELISA试验中,2倍标准差(2SD)是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时,一次超过2SD应作为“告警”,二次超出2SD为“失控”。当质控过程中出现失控时应查找原因,通常是试剂盒或质控血清失效造成。对更换试剂盒或更换质控血清仍然难以明确原因的应该进行最佳条件下已知值质控血清变异(OCV)检验。如果OCV检验的结果仍在正常范围,提示实验操作存在问题。双抗体夹心法测定抗原是基于待检抗原在固相抗体和酶标抗体间的桥接作用,一步法测定HBsAg时,如标本中HBsAg浓度过高,则因竞争抑制作用,难以形成“夹心复合物”,出现显色变浅甚至不显色的现象,称为HOOK现象,导致HBsAg的漏检。国内资料显示,一步法检测HBsAg的漏检率为0.47%。两步法,尤其是TRFIA检测法可最大限度地避免HBsAg的漏检。
HBV DNA定量检测
1.方法与原理HBV 定量检测目的在于明确乙型肝炎患者的病毒复制水平、判断患者病情、抗病毒疗效,对预后判定有一定的价值。目前用于HBV DNA的检测方法主要有两类:一类是以PCR为基础,如实时荧光定量PCR。另一类是以核酸杂交为基础,如斑点杂交和分枝DNA(bDNA)技术等。斑点杂交以定性检测为主,敏感性较差。实时荧光定量PCR技术是目前国内医疗机构应用最为广泛的检测方法。该反应体系内使用的标准品和内标为体外制备的质粒,酶切、纯化后-70℃保存效期为6年。国产试剂在检测灵敏度(104拷贝/ml)、测定范围(104～108拷贝/ml)等方面已基本达到国外同类产品水平。
2.检测低水平复制HBV HBV感染时间超过30年的患者,随着感染时间的延长,HBV血清标志物浓度也逐渐降低(HBsAg<0.5ng/ml),对这部分人群联合应用HBV DNA定性检测有助于HBV感染的诊断。
3. 质量控制 鉴于基因诊断操作较为复杂并要求严格质控,2005年末,卫生部临床检验中心已经对全国近500家三级医院的PCR实验室进行了认证和评估,并针对国内HBV核酸诊断试剂包装小、效期短、批号更换频繁的现状,每年开展2次室间质评。这在一定程度上提高了HBV DNA定量检测的水平,但对一个实验室每年2次的室间质评显然不能保证结果的准确性,对实验报告而言室内质控更为重。
PCR实验室室内质量控制旨在监测和控制实验室结果的精确度,以决定HBV DNA定量检测的报告能否发出。以下几个要点有助于完善室内质控:①质控值在均数±3SD以上的检测数据为质控失控,不能发送检测报告,立即查找原因,如质控品失效、污染等。②对于质控值在均数±2SD之内的数值变化应该注意规律,如果出现质控曲线的定向“漂移”现象,连续几天质控数值向一侧偏离,应该及时核查质控血清效期、试剂效期。③每个试剂批号的室内质控曲线分析、每个月室内质控曲线分析,有助于早期发现室内质控可能出现的问题。④制定规范并严格执行标准操作规程。
4.HBV cccDNA检测 HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的合成模板,是HBV持续感染的关键。近年来有关HBV cccDNA研究逐渐增多。但迄今为止,国内普遍应用的是实时荧光PCR定性试剂,尚无诊断试剂用于临床。
HBV 耐药检测
1.原理及方法 目前多数临床资料认为,乙型肝炎患者拉米夫定治疗过程中HBV出现YMDD变异是HBV耐药的转折点,因此YMDD变异检测已渐趋普遍。主要的检测方法有:①PCR扩增法:PCR扩增-限制性酶切片断多态性分析(PCR-RFLP)是目前国内实验室最常用的YMDD变异、rtA181V阿德福韦酯耐药、BCP区变异位点的检测方法。实时荧光PCR扩增是近期国内应用较多的HBV耐药检测方法。②基因芯片分析:包括流体芯片技术、探针杂交技术,主要通过逆向斑点杂交技术实现对变异位点的检测。③焦磷酸测序法:对YMDD突变质粒及血清标本的重复性及可靠性检测显示,质粒标准品的突变检出率及重复率为100%,而血清标本为98.8%。④基因克隆与测序:采用特异性引物对YMDD所在目的片断进行克隆后测序,通过与标准株的比较识别变异位点。这是所有检测方法中最为客观的检测方法,但操作复杂、成本高、耗时长是该方法的主要缺陷。
2.质量控制 上述核酸检测的室内质控目前主要采用内标技术,除少数实时荧光PCR技术试剂外,多数试剂目前国家药物食品管理局尚未批准用于临床检测,标准品制备尚未规范化管理,室间质评因此未能进行。
3.耐药结果解读 尽管目前多数学者认为YMDD变异是确定核苷类似物停药的基本参考指征,但近期韩国学者对740例接受拉米夫 定治疗的乙型肝炎患者HBV编码蛋白MALDI-TOF质谱分析显示,整个治疗过程中均可检测到YMDD变异的存在。研究者认为低水平YMDD变异的存在并非预示HBV DNA复制的再次活跃,与野生株相比,5倍的YMDD变异则高度提示HBV DNA复制的再次活跃。研究提示,对耐药位点的检测结果需要充分考虑HBV准种对检测结果的影响。
HBV基因分型检测
根据目前的研究资料,亚洲尤其是东南亚HBV基因型与感染者预后相关。日本和我国台湾地区的研究资料显示,HBV基因型除与感染的地域有关外, 也与感染者预后和肝损伤程度相关。如B型HBV感染者肝损伤程度和纤维化程度相对较轻,但肝癌发病年龄相对比C型提前5～10年。基因分型检测方法与基因变异检测基本相同,目前国内没有商用试剂盒可用。室内质控和室间质评也有待规范。
2003年2月, 国际标准化组织针对医学实验室制订了《医学实验室质量和能力专用要求》(ISO15189)。医院实验室出具的检测结果是否准确,能否达到相关实验室的互认或参考,不是简单地统一各实验室的检测仪器、试剂、检测步骤,而是通过各个实验室按照ISO15189标准对实验室认可来实现的。因此,规范实验室管理,全面提高整体实验室管理水平是真正实现实时质控、提升检测质量的关键。
