CRISPR/Cas9 技术培训背景介绍：
CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御，可用来有效抵御病毒及外源 DNA 的入侵。CRISPR 的 TypeII 已经被广泛用于基因工程，它包含 Cas9，crRNA 和 tracrRNA，其中 crRNA 含有能够识别 20bp 的靶向互补序列。
Cas9，crRNA 和 tracrRNA 组成复合体，识别并结合 crRNA 互补的序列，然后解开 DNA 双链，Cas9 中的 HNH 活性位点剪切 crRNA 的互补 DNA 链，RuvC 活性位点剪切非互补链，最终导致 DNA 的双链断裂（DSB），进而实现基因的敲除和插入。
目前，CRISPR/Cas9 系统已经广泛用于对哺乳动物细胞，细菌，斑马鱼，小鼠，猪，猴的基因编辑。本学习班将详细讲解 CRISPR/Cas9 基因编辑工具原理，操作流程，理论结合实践，将让大家详细了解到具体如何利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因修饰动物等。学习班将为相关科研工作人员和兴趣爱好者提供了很好的培训资源。
讲师介绍
李博士，德国慕尼黑工业大学海归博士，具有多年丰富的基因编辑实操经验，参与德意志研究基金委项目 (DFG) 用于人类癌症研究的转基因克隆猪模型 (SCHN971/3-1)。
博士导师为原英国 Roslin Institute 克隆羊「多莉」团队的 Prof. Dr. Angelika Schnieke。成功构建世界上第一头 ROSA26 双荧光猪模型，极具有生物医学价值 (已发表)。
随后，成功构建 Kras 点突变基因修饰克隆猪模型，该模型为构建胰腺癌大动物模型提供了有力工具，为胰腺癌相关靶向药物开发，寻找新的胰腺癌治疗手段等提供了新的动物模型。
熟练掌握载体构建，基因打靶 (如用传统 targeting vector 或 TALENs, CRISPR/Cas9 介导的基因 Knock-out 和 Knock-in)，
Cre/loxP 系统，动物细胞分离和培养，细胞转染 (Electroporation, Nucleofection,Nanofection,Stemfect RNA transfection)，DNA 甲基化和 RNA 甲基化分析，焦磷酸测序，各种分子生物学实验 (Southern blot, Western blot, qPCR, RT-PCR) 等技术。有较强的分子生物学，细胞生物学，遗传学，生物信息学，发育生物学，动物生物技术等理论基础。博士期间共指导德国学生 3 人
日程安排
第一天 周六 上午 9:00-12:00
理论一：基因修饰技术简介
1、基因打靶与基因编辑技术（ZNF, TALENs，CRISPR/Cas9）介绍。
2、CRISPR/Cas9 结构和特点。
3、如何使用 CRISPR/Cas9 系统对特定基因进行敲除或定点插入（详细方法步骤）
4、新基因编辑工具 Cpf1 的结构、特点、工作原理（基因编辑工具知识拓展）。
5、如何使用 Cpf1 系统对特定基因进行敲除或定点插入。
6、Cpf1 与 CRISPR/Cas9 的异同。
7、Cpf1 的应用和技术展望。
8、CRISPR/Cas9 系统介绍的相关值得推荐的视频。
理论二：CRISPR（sgRNA）设计方法和相关网站介绍
1、sgRNA 设计方法和相关网站介绍。
实验一：CRISPR（sgRNA）的在线设计（请自带可无线上网之笔记本电脑或手机）（在线互动设计演练）
2、sgRNA 设计后挑选 sgRNA 经验和心得分享。
第一天 下午 13:00-18:00
实验：
1、gRNA oligos 模板退火
2、退火 gRNA 与线性化 CRISPR/Cas9 载体连接。
3、连接产物转化到大肠杆菌（DH5α）。
4、转化产物涂板培养。
5、基因编辑质粒 ps330A 和 ps330S 系列如何具体构建和使用。
理论三：CRISPR/Cas9 作为基因编辑工具的实验用处，案例：
1、Cas9 的多功能系统（如 Cut, Nick, Activate, dCas9-FokI）的详细介绍。
2、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰小鼠方法与相关基因修饰小鼠模型介绍。
3、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物（猪、猴）方法与相关基因修饰大动物模型介绍
第二天 周日 上午 9:00-12:00
理论四：利用 CRISPR/Cas9 技术编辑动物细胞系
1、CRISPR/Cas9 质粒细胞转染方法。
2、阳性细胞克隆筛选。
3、基因编辑细胞系的建立。
4、基因修饰情况分析方法
实验：
1、CRISPR/Cas9 重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定。
2、基因修饰基因组 DNA 模板（转染 CRISPR/Cas9 到动物细胞后提取 DNA）制备。
3、目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增，电泳检测 PCR 产物。
4、PCR 产物退火变性，T7E1 酶切，电泳鉴定基因修饰情况。
理论五：利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除或敲入小鼠。
1、基因编辑工具 CRISPR/Cas9 基本背景介绍。
2、sgRNA 设计及其功能验证。
3、小鼠受精卵分离和培养。
4、CRISPR/Cas9 系统显微注射到小鼠受精卵。
5、受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内。
6、PCR 和 T7E1 分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder）
7、基因敲除小鼠基因敲除情况分析。
8、CRISPR/Cas9 构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结。
第二天 周日 下午 13:00-17:00
实验：实验结果的点评与讨论。
1、CRISPR/Cas9 载体构建讨论
2、目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增，电泳检测 PCR 产物结果讨论
3、PCR 产物 T7E1 酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论
4、Sanger 测序鉴定基因编辑结果。
CRISPR/Cas9 质粒阳性转化子测序结果确认
anger 测序阅读基因编辑情况
如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型
理论六：利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因修饰大型动物（猪）。
1、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大型动物（猪）流程
2、基因修饰大型动物优势
3、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物（猪）模型介绍
理论七：CRISPR/Cas9 脱靶问题分析
1、脱靶产生的原因
2、脱靶检测方法
3、降低脱靶问题的方法
理论八：
1、CRISPR/Cas9 技术的发展与应用
2、新基因编辑工具 Cpf1，C2C2 的用法与比较
3、基因编辑工具的伦理问题
4、基因编辑工具的应用拓展。
5、根据学员的研究内容，详细答疑如何使用基因编辑工具。
学习班时间、地点
培训时间：2017 年 9 月 23 日-9 月 24 日
培训地点：上海中兴和泰酒店会议厅，上海市浦东张江高科科苑路 866
收费标准
注册费：2700 元每位（注册费包含电子版教材、午餐，欢迎晚宴费用，住宿费自理）。
优惠措施：
1、9 月 10 号之前确认报名及转账的优惠 200 元
2、三人组团报名，每人可优惠 200 元
3、五人组团参会，领队人可以免费注册！
注：可以开正规会务发票，纸质邀请函（盖红章）。
注意点：建议每人可以带笔记本电脑！
推荐下面三个基因编辑用的质粒可以选择订购，每个质粒 500 元（发票单独开）
1、ps330A-cas9-sgRNA（可插入任意 20bp 靶点序列）
2、ps330S-2-cas9-sgRNA（可用于同时敲除 2 个靶点的载体）
3、p-p53-cas9-GFP（可用于小鼠 p53 基因敲除的载体）
