上海 CRISPR/Cas9 基因编辑技术学习班

作者:   2017-07-29
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CRISPR/Cas9 技术培训背景介绍:

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期选择压力中形成的一种适应性免疫防御,可用来有效抵御病毒及外源 DNA 的入侵。CRISPR 的 TypeII 已经被广泛用于基因工程,它包含 Cas9,crRNA 和 tracrRNA,其中 crRNA 含有能够识别 20bp 的靶向互补序列。

Cas9,crRNA 和 tracrRNA 组成复合体,识别并结合 crRNA 互补的序列,然后解开 DNA 双链,Cas9 中的 HNH 活性位点剪切 crRNA 的互补 DNA 链,RuvC 活性位点剪切非互补链,最终导致 DNA 的双链断裂(DSB),进而实现基因的敲除和插入。

目前,CRISPR/Cas9 系统已经广泛用于对哺乳动物细胞,细菌,斑马鱼,小鼠,猪,猴的基因编辑。本学习班将详细讲解 CRISPR/Cas9 基因编辑工具原理,操作流程,理论结合实践,将让大家详细了解到具体如何利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因修饰动物等。学习班将为相关科研工作人员和兴趣爱好者提供了很好的培训资源。

讲师介绍
李博士,德国慕尼黑工业大学海归博士,具有多年丰富的基因编辑实操经验,参与德意志研究基金委项目 (DFG) 用于人类癌症研究的转基因克隆猪模型 (SCHN971/3-1)。

博士导师为原英国 Roslin Institute 克隆羊「多莉」团队的 Prof. Dr. Angelika Schnieke。成功构建世界上第一头 ROSA26 双荧光猪模型,极具有生物医学价值 (已发表)。

随后,成功构建 Kras 点突变基因修饰克隆猪模型,该模型为构建胰腺癌大动物模型提供了有力工具,为胰腺癌相关靶向药物开发,寻找新的胰腺癌治疗手段等提供了新的动物模型。

熟练掌握载体构建,基因打靶 (如用传统 targeting vector 或 TALENs, CRISPR/Cas9 介导的基因 Knock-out 和 Knock-in),
Cre/loxP 系统,动物细胞分离和培养,细胞转染 (Electroporation, Nucleofection,Nanofection,Stemfect RNA transfection),DNA 甲基化和 RNA 甲基化分析,焦磷酸测序,各种分子生物学实验 (Southern blot, Western blot, qPCR, RT-PCR) 等技术。有较强的分子生物学,细胞生物学,遗传学,生物信息学,发育生物学,动物生物技术等理论基础。博士期间共指导德国学生 3 人

日程安排
第一天 周六 上午 9:00-12:00
理论一:基因修饰技术简介
1、基因打靶与基因编辑技术(ZNF, TALENs,CRISPR/Cas9)介绍。
2、CRISPR/Cas9 结构和特点。
3、如何使用 CRISPR/Cas9  系统对特定基因进行敲除或定点插入(详细方法步骤)
4、新基因编辑工具 Cpf1 的结构、特点、工作原理(基因编辑工具知识拓展)。
5、如何使用 Cpf1 系统对特定基因进行敲除或定点插入。
6、Cpf1 与 CRISPR/Cas9 的异同。
7、Cpf1 的应用和技术展望。
8、CRISPR/Cas9 系统介绍的相关值得推荐的视频。
理论二:CRISPR(sgRNA)设计方法和相关网站介绍
1、sgRNA 设计方法和相关网站介绍。
实验一:CRISPR(sgRNA)的在线设计(请自带可无线上网之笔记本电脑或手机)(在线互动设计演练)
2、sgRNA 设计后挑选 sgRNA 经验和心得分享。
第一天 下午 13:00-18:00
实验:
1、gRNA oligos 模板退火
2、退火 gRNA 与线性化 CRISPR/Cas9 载体连接。
3、连接产物转化到大肠杆菌(DH5α)。
4、转化产物涂板培养。
5、基因编辑质粒 ps330A 和 ps330S 系列如何具体构建和使用。
理论三:CRISPR/Cas9 作为基因编辑工具的实验用处,案例:
1、Cas9 的多功能系统(如 Cut, Nick, Activate, dCas9-FokI)的详细介绍。
2、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰小鼠方法与相关基因修饰小鼠模型介绍。
3、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物(猪、猴)方法与相关基因修饰大动物模型介绍
第二天 周日 上午 9:00-12:00
理论四:利用 CRISPR/Cas9 技术编辑动物细胞系
1、CRISPR/Cas9 质粒细胞转染方法。
2、阳性细胞克隆筛选。
3、基因编辑细胞系的建立。
4、基因修饰情况分析方法
实验:
1、CRISPR/Cas9 重组子细菌克隆挑取,扩大化培养,鉴定。
2、基因修饰基因组 DNA 模板(转染 CRISPR/Cas9 到动物细胞后提取 DNA)制备。
3、目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增,电泳检测 PCR 产物。
4、PCR 产物退火变性,T7E1 酶切,电泳鉴定基因修饰情况。
理论五:利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因敲除或敲入小鼠。
1、基因编辑工具 CRISPR/Cas9 基本背景介绍。
2、sgRNA 设计及其功能验证。
3、小鼠受精卵分离和培养。
4、CRISPR/Cas9 系统显微注射到小鼠受精卵。
5、受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内。
6、PCR 和 T7E1 分析和鉴定基因敲除小鼠(Founder)
7、基因敲除小鼠基因敲除情况分析。
8、CRISPR/Cas9 构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结。
第二天 周日 下午 13:00-17:00
实验:实验结果的点评与讨论。
1、CRISPR/Cas9 载体构建讨论
2、目的靶基因的基因组 DNA 片段的 PCR 扩增,电泳检测 PCR 产物结果讨论
3、PCR 产物 T7E1 酶切,电泳鉴定基因修饰情况结果讨论
4、Sanger 测序鉴定基因编辑结果。
CRISPR/Cas9 质粒阳性转化子测序结果确认
anger 测序阅读基因编辑情况
如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型
理论六:利用 CRISPR/Cas9 技术构建基因修饰大型动物(猪)。
1、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大型动物(猪)流程
2、基因修饰大型动物优势
3、利用 CRISPR/Cas9 构建基因修饰大动物(猪)模型介绍
理论七:CRISPR/Cas9 脱靶问题分析
1、脱靶产生的原因
2、脱靶检测方法
3、降低脱靶问题的方法
理论八:
1、CRISPR/Cas9 技术的发展与应用
2、新基因编辑工具 Cpf1,C2C2 的用法与比较
3、基因编辑工具的伦理问题
4、基因编辑工具的应用拓展。
5、根据学员的研究内容,详细答疑如何使用基因编辑工具。

学习班时间、地点
培训时间:2017 年 9 月 23 日-9 月 24 日
培训地点:上海中兴和泰酒店会议厅,上海市浦东张江高科科苑路 866

收费标准
注册费:2700 元每位(注册费包含电子版教材、午餐,欢迎晚宴费用,住宿费自理)。

优惠措施:
1、9 月 10 号之前确认报名及转账的优惠 200 元
2、三人组团报名,每人可优惠 200 元
3、五人组团参会,领队人可以免费注册!
注:可以开正规会务发票,纸质邀请函(盖红章)。

注意点:建议每人可以带笔记本电脑!

推荐下面三个基因编辑用的质粒可以选择订购,每个质粒 500 元(发票单独开)
1、ps330A-cas9-sgRNA(可插入任意 20bp 靶点序列)
2、ps330S-2-cas9-sgRNA(可用于同时敲除 2 个靶点的载体)
3、p-p53-cas9-GFP(可用于小鼠 p53 基因敲除的载体)

编辑: 潘文娟   

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