武汉大学人民医院肿瘤中心 宋启斌 胡 胜
宋启斌教授因事未到场，由胡胜代为报告
PPT之一
PPT之二
摘要 TNM分期系统虽然在治疗选择、预后判断中发挥重要作用，但并不是癌症(包括NSCLC)治疗策略的完美标准。使用基因组、蛋白组技术，已经发现了多种关键基因、突变(如EGRF)和细胞内信号分子、通路——生物标志，可能与肺癌的分期、预后和药物敏感性有关，但临床使用的价值目前还未取得完全一致。联合多个生物标志，甚至以整个信号通路为标志，优化NSCLC个体化治疗进行的时代将会到来。
一、 肺癌的流行病学
在世界范围内，肺癌的发生率居恶性肿瘤第二位，但为恶性肿瘤死亡的首要原因。2002年全世界肺癌的新发病例为130万，几乎一半(49.9%)发生在发展中国家。估计到2020年每年新诊断的肺癌患者仍会持续升高。2007年美国新诊断的肺癌患者预计为213 380，死亡患者为160 390。我国2000年肺癌男性调整发病率为38.5/10万，死亡率33.2/10万；女性调整发病率为15.7/10万，死亡率为13. 5/10万；2000年到2005年，肺癌的发生率上升了30.5%。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的80%，其疗效令人失望，美国5年生存率为15%，欧洲为10%，发展中国家甚至低于8.9%。复发和重要器官的转移是治疗失败的主要原因。
二、 NSCLC个体化治疗的现状
癌症个体化治疗是指根据每个患者的不同病情，制定特异的治疗方案，给予患者最适当有效的治疗，但目前的NSCLC个体化治疗还仅停留在TNM分期的层次上。
TNM 分期系统由AJCC(American Joint Committeeon Cancer)于1958年颁布，几乎专门依据疾病的解剖学范围制定。其主要功能是提供预后信息，选择初始治疗策略；其次是在临床试验中分层患者，使医学中心之间的研究结果交流更准确。偶尔，若AJCC认为肿瘤的分级、细胞学亚型或患者的年龄可以提高预计生存的准确性或治疗反应，也会被加入到TNM系统。
但TNM分期系统并不能解释同样的分期和治疗方案，患者其预后差异很大甚至截然不同的现象。提示TNM分期不是选择癌症(包括NSCLC)治疗的完美标准。
庆幸的是，目前对于预后判断和选择治疗方法，出现了新的机会。首先，依据基因表达标志的差异可将NSCLC分为预后有明显差异的亚型(独立于传统的病理学分类)，从而在分子水平上指导肺癌的个体化治疗。
第二，与TNM提出的时代不同，新型化疗药物更有效和更广泛的使用，如紫杉醇、吉西他滨、长春瑞滨、培美曲赛。
第三，新的靶向药物，如Erlotinib (Tarceva)，Gefitinib (Iressa)和Heceptin，仅仅对具有特异分子标志的患者有效。如Gefitinib用于肺癌的治疗，疗效由EGFR基因突变、拷贝数目所决定，提示EGFR基因状态也是一种分子生物标志。
虽然目前生物标志还没有正式加入NSCLC的TNM分期系统，但新发现的肺癌生物标志，用于NSCLC个体化治疗的研究已经取得了重大进展。可以预计，生物标志正式加入到TNM分期系统，或作为一个补充进行协同评估(co-evaluation)的时代即将到来。
三、 NSCLC中的生物标志
恶性细胞的增殖和转移一般由原癌基因激活、肿瘤抑制基因的失活和/或DNA修复机制失活导致，以及其他异常，如RNA的表达、蛋白的翻译和翻译后的修饰和功能。
因此，DNA基础的生物标志包括SNP(单核苷酸多态性)、染色体异常、DNA拷贝数目异常以及各种启动子区域的甲基化。RNA的生物标志包括，基因过表达或低表达，各种调节RNA(如小RNA、微RNA)。蛋白生物标志包括细胞膜表面分子、肿瘤抗原、蛋白磷酸化、糖基化状态。
当然，肺癌的肿瘤生物标志也可分为血清生物标志、组织生物标志、分泌物(唾液、痰液)生物标志。血清生物标志最具吸引力，因为其在任何时候均容易获得；含有大量的生物信息(如低分子量的血清多肽组，Peptidome)。NSCLC的生物标志除了常见的CEA、NSE外，还包括生长因子及其受体、癌基因，如K-ras、EGFR和HER-2。此外，还有细胞周期特异蛋白和凋亡调节分子，如p53、Bcl2、Rb和p16INK4a。其他包括DNA修复相关分子、VEGF、干细胞因子(stem cell fator，SCF)和肝细胞生长因子(HGF)。联合多个标志比单个标志更有选择性和有效性。
尽管已发现生物标志可能与肺癌的分期或预后有关，但目前的临床使用的价值还未取得一致。但是，反应一些关键细胞内信号通路的生物标志的研究已经取得相当大的进展，尤其特异的受体酪氨酸激酶信号通路(EGFR)。
四、 生物标志物与NSCLC的诊断分类
在肺癌中，目前一个重要的方向是使用基因和蛋白微阵列(芯片)探讨癌症细胞的分子生物学特性。Sugita等用基因芯片和组织芯片检测肺癌细胞系和187例临床NSCLC标本，发现癌症/睾丸抗原(Cancer/Testis Antigens，CTAg)可以作为中央型肺鳞癌和小细胞肺癌的生物标志物，用于早期诊断和疗效监测。Inamura等对48例鳞癌使用40 386基因进行筛查，发现91个与细胞分化有关的基因在预后好的组高表达，而1 499个与翻译功能相关的基因在预后差的组高表达。
生物标志物用于肺癌分类研究的最多的是肺腺癌(腺癌的发生率最高)。2001年，Bhattacharjee等首次使用微阵列方法对186例肺癌(127例腺癌)和17正常肺组织进行分析，发现腺癌可以再分为4类(C1、C2、C3和C4)，C1主要表达增殖相关的基因，C2神经内分泌相关的基因表达，C3主要表达鸟氨酸脱羧酶和谷胱甘肽-S-转移酶基因，C4主要表达Ⅱ型肺泡上皮标志。这种分类与临床病理也存在联系，C1大多是分化差的肿瘤，而C3、C4为分化好的肿瘤；C2居中。随后，Takuechi等对149例NSCLC(90例腺癌)进行18 175个基因表达分析，发现腺癌可以分为2类，终末呼吸单位型(TRU)和非终末呼吸单位型，前者有更高的EGFR突变和更差的预后。
随后Beer使用微阵列技术对腺癌分析，发现使用50个基因可以将患者分为高危险和低危险2类，可以明显判断早期肺癌的生存时间。Potti等对198例早期NSCLC分析发现，使用多基因表达标签——metagene，可以预计患者是否发生复发，具有72%~79%的准确性。也有研究发现，使用128个基因的表达标签可以预计肺癌的患者是否发生转移。
然而，微阵列在临床上使用受到限制。近来，Chen等使用RT-PCR方法分析了125例NSCLC患者，从672个具有侵袭特点基因中筛查16个与生存有关的基因，发现DUSP6、MMD、STAT1、ERBB3和LCK是5个高危险基因，是患者无复发生存时间的独立预后因子。
2006年，Bild等里程碑的研究发现，完整的癌基因通路激活状态也可指导癌症的分类和靶向性治疗。作者对NSCLC的研究发现，Ras通路的状态明显与组织学亚型相关，大多数腺癌标本同鳞癌相比，存在Ras的调节异常。进一步使用聚类分析发现，可以将肺癌分为Ras通路低激活和Myc、E2F3、β-catenin和Scr高激活的组，Ras通路高激活和Myc、E2F3、β-catenin和Scr低激活的组以及Ras通路高激活和Myc、E2F3、β-catenin和Scr高激活的组，不管组织类型如何，通路高度激活组的患者有更差的预后(19.7vs51.3月)。同以前的微阵列分析多个联系不明显的基因进行癌症分类不同，完整的癌基因通路激活状态可以提供新的治疗机会。如使用多个药物或多靶点药物对全通路特异性治疗，也许可以解决目前靶向药物的联合治疗并不比单药疗效好的问题。
目前已有研究使用miRNA表达标志分类癌症、判断癌症患者的预后。Lu等近来研究发现，准确分类人类所有癌症仅仅需要很少的miRNA(约200个基因)。来源于不同组织的癌症使用其表达的miRNA可以归结为一类，可能导致肿瘤的分类是依据其胚胎起源而不是器官。如上皮来源的癌症，结肠、肝脏、胰腺和胃，可以归为一类；而造血细胞起源的肿瘤也归为一类。
Takamizawa等提供了更直接的证据，在人类肺癌中，let-7存在明显下调，而且let-7表达水平低的NSCLC的患者预后更差，手术后生存时间的更短，提示let-7具有诊断意义。Nozomu等最近使用微阵列研究肺癌的miRNA的表达标志发现，miRNA与包括Ⅰ期在内的肺腺癌患者的生存时间存在联系，高mir-155和低let-7a-2表达与患者的预后差存在联系。将来，对来源于每一类肿瘤，可以建立miRNA表达文库或miRNA表达标志，指导癌症的诊断和治疗。由于miRNA可以简单的从福尔马林固定，石蜡包埋的组织中提取。
五、 生物标志物(基因组、蛋白组标签）与NSCLC的化疗药物选择
基因组标签(Signature)开始用于癌症的分类，目前，又开始用于指导细胞毒化疗药物的选择。Dan等使用39个肿瘤细胞系分析了55种化疗药物处理后的基因表达谱，发现了50个与化疗敏感性相关的基因，提示基因组标签可以作为生物标志物预测肿瘤化疗药物的敏感性。
2006年Potti等对包括肺癌细胞系的研究发现，使用微阵列分析方法，含有50个基因的表达可以预计肺癌细胞系对紫杉醇的敏感性，对于临床标本准确率可达到80%。同样，基因组表达标签也可预计其他药物，如阿霉素、5-Fu、Vp-16、CTX和拓普替康，而且还可预计联合化疗的敏感性。这些基因包括微管蛋白、TP53、亚甲基四氢叶酸还原酶、外切修复基因(ERCC4)、Rb通路基因和BCL2等。2007年，Julian等使用更新的SiRNA文库技术寻找决定紫杉醇和其他细胞毒药物敏感性的基因，样本包括NSCLC的3个肿瘤细胞系，发现了多个紫杉醇耐药的基因，包括参与纺锤体组装检验点的基因，BUB1B、AURKB；以及神经酰胺转运和合成的基因，COL4A3BP、β-葡(萄)糖苷酶基因。
最近，Taguchi等使用血清标本的质谱分析发现了预测EGFRTKI敏感性的生物标志。作者先对139例使用gefitinib的NSCLC进行试验分析，发现了8个特异的蛋白m/z特征(生物标志)，判断预后的准确性达97.1%。然后对2个独立的使用Erlotinib或Gefitinib的人群进行确认，发现使用此标志，好预后的患者中位生存时间为207和306天，差预后的为92和107天。血清标本临床易得，所以此研究具有重大意义，为NSCLC个体化治疗的真正临床实践开启了一扇大门。
总之，将来对NSCLC治疗的选择，也许将来应采取如下更加个体化的模式(图1)。
图1 未来NSCLC治疗的选择
当然，上述研究也存在不足，如未得到设计个很好的随机对照的前瞻性研究证实，而且各种微阵列的分析平台也需要统一。
六、 生物标志物与肺癌的个体化治疗
(一) EGFR突变与NSCLC
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)具有受体酪氨酸激酶活性(receptor tyrosinekinase，RTK)。EGFR为跨膜受体，由细胞外的配体结合区域和细胞内的酪氨酸激酶活性区域组成。EGFR的小分子抑制剂主要有2个——Gefitinib和Erlotinib，分别于2003和2004年在美国获FDA批准上市，用于对传统化疗无效的晚期NSCLC患者。
Gefitinib、Erlotinib的高敏感性与EGFR的体细胞性(somatic，不同于先天性)突变明显相关。在非选择性NSCLC标本，EGFR突变率在北美和西欧为10%，而在东亚为30%~50%。EGFR突变均发生于4个外显子中(18-21)，编码EGFR部分的酪氨酸激酶区域(全部由18-24编码)。主要突变有：外显子19的缺失(4个氨基酸：LREA)，外显子21的L858R点突变，外显子18的G719S点突变，以及外显子20的770插入突变(具体如图2)。
