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功能基因报告系统与流式技术

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发布日期:2012-10-10 15:51 文章来源:丁香园
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关键词: 分子生物 流式技术 技术专题 碧迪 丁香园 丁香通   点击次数:

报告基因(reporter gene)是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因,或与其它目的基因相融合,在调控序列控制下进行表达,从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控,筛选得到转化体。

报告基因应用:目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多事件。报告基因种类:氯霉素乙酰基转移酶基因(CAT)、荧光素酶基(Luciferase)、人生长激素基因(hGH)、分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP),其中β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase / lacZ )和绿色荧光蛋白基因(GFP), β-内酰胺酶基因(β- lactamase)。

流式技术与报告基因

随着技术和检测方法的进步,荧光分析以其能够将细胞内报告基因的活性可视化和对细胞的非破坏性而越来越成为主流,其中流式细胞仪就可以可对β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)、β-内酰胺酶( β- lactamase )和荧光蛋白基因(比如CFP、GFP、YFP、RFP)进行分析检测和对相应的细胞进行分选。

β-半乳糖苷酶和β-内酰胺酶活性流式分析

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase / lacZ )活性流式分析

流式检测原理图



编码β-galactosidase LacZ基因整合到目的细胞在加入2-脱氧葡萄糖的氟代衍生物-12(C12FDG)的培养基中孵育,如果细胞表达β-galactosidase,它可以使C12FDG降解发出绿色的荧光,因为C12FDG可以连接到细胞膜上,细胞就发出绿色的荧光,在流式细胞仪上可通过488激发和500-510nm的检测通道检测。

β-内酰胺酶β-lactamase活性流式分析

流式检测原理图



Coumarin cephalosporin fluorescein( CCF2/AM)可进入细胞质被405激光激发产生绿色荧光,流式细胞仪520/10检测通道检测;若转入的基因表达β-lactamase,其可以作用于CCF2后发出红色的荧光。流式细胞仪460/50检测通道检测。

流式分析  β-内酰胺酶和β-半乳糖苷酶

摘自:Detection of β-Lactamase Reporter Gene Expression by Flow Cytometry

Tom Knapp , Eric Hareet al. Cytometry Part A 51A:68-78 (2003)


图释:BD FACSLSR检测未刺激的C84和C37Jurkat细胞的报告基因低表达水平A:C84Jurkat细胞培养的时间过程。B:C37Jurkat细胞培养的时间过程。C-K:未刺激细胞(红色)和野生型对照(绿色)和阳性对照(刺激的细胞,蓝色)在同一个时间点图。(在每一个时间点上未刺激组都有一定的阳性百分数)。



图释:β-Lactamase/CCF2方法灵敏度。R3显示的阳性区域。1:106时依然能够检出阳性样本。

图释:lacZ/FDG方法灵敏度,1:105时样本X轴的变化已经非常大。

结论是β-Lactamase/CCF2的检测灵敏度要高于β-Lactamase/CCF2 10倍以上。

荧光蛋白的流式分析和分选

流式检测原理图

 

  
 

荧光蛋白的多色标记文献:

摘自:Multiparameter Flow Cytometry of Fluorescent Protein Reporters.

Teresa S. Hawley, Donald J. Herbert,et al. Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.



图释:BD FACSVantage采用 488nm和407nm激光器同时检测ECFP、EGFP、EYFP和DsRed。A、B分别显示Sp2/0-Ag14细胞只表达一种荧光蛋白混合后,补偿前及补偿后。C、D显示Sp2/0-Ag14细胞只表达一种荧光蛋白及表达四种荧光蛋白混合物,补偿前及补偿后。

抗病基因检测,不同植物根部转基因假单胞菌表达分析

摘自:Combination of Fluorescent Reporters for Simultaneous Monitoring of Root Colonization and Antifungal Gene Expression by a Biocontrol Pseudomonad on Cereals with Flow Cytometry

Laurène Rochat, Maria Péchy-Tarr, et al. MPMI Vol. 23, No. 7, 2010, pp. 949-961.



图释:BD FACSCalibur检测Wheat与Arina根部环境中,mcherry标记的假单胞菌CHA0报告基因phlA-GFP 的表达情况。A,分析携带phlA- GFP的CHA0,mcherry与GFP分别用FL3-H和FL1-H通道检测,能很好地区分开细菌与背景噪音,FL3-H和FL1-H圈门后的细胞进一步圈为R1。B,M1圈出GFP阳性细胞群,并显示R1门的细胞。C,FSC-H/FL1-H圈门区分GFP+/-细胞。D,在C的基础上进一步用M2分析后,96.97%的样本为细菌。

总结:流式在细菌与植物研究中的应用优势:GFP及DsRed的各种变体被广泛用于的植物种子、根、叶与细菌的相互作用,本实验的研究发现P. fluorescens CHA0中mCherry能与GFP更好的共表达, DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed.T3_S4T、mRFP1与GFP作为双报告系统都不适合,说明mCherry与GFP是一种更可靠的的双报告系统,该组合已被广泛应用于细胞定位、微生物基因报告的研究中。此外,文章中提及,与荧光显微镜相比,流式检测的优势在于:信息全面,可以进行单细胞水平、高通量、特异表达分子的研究;流式可以检测到阴性表达的菌,而荧光显微镜不能,因而不能检测阳性表达率,且流式的敏感度明显提高、定量是CFU 的10倍。

信号转导蛋白表达研究

摘自:Transduction of Wnt11 Promotes Mesenchymal Stem Cell Transdifferentiation into Cardiac Phenotypes

Zhisong He, Hongxia Li et al. Stem Cells Dev. 2011 October ; 20(10): 1771-1778.



图释4:BD FACSAria检测wnt11-MSC分化为心肌细胞形态。(A)荧光显微镜检测显示MSC与CMs孵育7天后,分化的CM (GFP+/α-actinin+cell),未分化的MSC细胞(GFP+/α-actinin-cell) 。(B)电子显微镜检测显示,典型的CM有明显的肌纤维、单核。MSC细胞没有肌纤维、多核(红色箭头)。由MSC分化的CM细胞既表现为多核,也出现肌小节。(C, D) 流式检测分别转入MSCNull与MSCWnt11的细胞表现(P < 0.05)。



图释:肌源性转化的MSCs参与了细胞融合,以及与CM细胞间出现Connexin 43 (A) BD FACSAria分析PKH26+/GFP+细胞。 (B-F) 代表荧光显微镜成像结果PKH26 (红色,CM细胞标记B), GFP 绿色, C), 细胞核 (蓝色, D), 以及Connexin 43(白色, E)。

体内启动子筛选-流式分选

摘自:Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry

Dirk Bumann,et al. Molecular Microbiology (2002) 43(5), 1269-1283

 

          



图释:采用BD FACSort从沙门氏菌的基因库中经过3次分选,筛选出4个在体外低表达、体内高表达GFP标记的克隆,黑色的为脾脏感染24小时后的水平,竖线是LB培养基的水平,灰色为SL1344在LB培养基中的GFP强度,作为背景对照。

总结:流式的优势在于

(1)检测的高灵敏度:可以从大量被感染的组织细胞中(自发荧光强)区分出GFP阳性表达的细菌颗粒;

(2)通过多次流式细胞分选,保证了实验的精确性。

编辑: gaowei2010

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