小鼠精原细胞倍性分析分选
研究背景:
精子发生是一个十分复杂但又高度有序的细胞分化过程，由精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成3个阶段组成，因此，睾丸内包含各类生精细胞：精原细胞（2n）、减数分裂期的精母细胞（4n/2n）、减数分裂后的精子细胞（n），睾丸细胞的异质性增加了对精子发生分子机制研究的难度，而精子发生的研究得益于分离各分化阶段的生精细胞技术的发展。流式细胞术可依据DNA含量、细胞物理参数（FSC、SSC）以及线粒体的变化从睾丸中分离出各类生精细胞。 Hochest33342能够渗入活细胞的细胞膜，进入细胞核特异的结合在DNA A-T碱基上，能够精确反映出DNA含量的差异和染色体的结构，因此可用于各生精细胞的分析分选，因Hochest33342这个染料需紫外或近紫外激光激发，而细胞DNA含量的差异要求仪器检测灵敏度和分辨率要高，因此可以说，该实验对仪器配置和仪器的检测分辨率要求都很高。
实验案例:
某高校分析测试中心是大型仪器共享平台，该中心目前汇集了生物医学领域中众多的先进仪器设备，包括激光共聚焦显微镜和两台BD流式细胞仪：FACSCalibur和FACSAria SORP，为生物医学的科学研究提供一流的实验技术平台。
本实验取小鼠睾丸细胞，用Hochest33342进行染色，BD FACSAria Sorp倍性分析后分选其中的初级精母细胞（4N），分选出的初级精母细胞后续用来抽提RNA。
A．流式图谱–散射光信号
B．流式图谱–Hochest33342染色样本
图释：小鼠睾丸细胞倍性分析，可清楚看到各倍体细胞群：N、2N、4N
结果讨论:
DNA倍体分析是流式细胞仪最早，且目前仍是最为广泛的应用之一。恶变细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA倍体分析对人肿瘤的预后诊断有很高的应用价值。DNA倍体分析还可提供细胞周期信息，所以也是细胞生物学的一个有用工具。DNA倍体的判定是根据所测细胞群DNA含量分布直方图G0/G1峰的DNA相对含量值、即DNA指数值进行判定的，理论上，二倍体的DNA指数（DNA含量值，表其相对DNA含量）应为1，四倍体的DI值应为2，但实际所测 DNA含量的直方图的G0/G1峰是个正态分布，测定过程中就有存在一定漂移，为精确解释这种漂移现象，流式细胞术的DNA倍体分析引入变异系数又称CV值，实测结果的CV值包括两部分，即反应仪器精度的CV值和实验样品的CV值，排除样本的制备因素，单就仪器精度而言，若仪器检测分辨率不高，CV值高，G0/G1峰就很宽，G0/.G1期与S期就无法区分开，因此，DNA倍体分析对于仪器的检测分辨率要求很高，要想得到优质的DNA倍体分析结果，仪器分辨率一定要高，CV值要低。
本案例用BD FACSAria SORP的UV紫光进行Hochest33342染色的小鼠睾丸精原细胞倍体分析分选，从单参数直方图可见，单倍体（N）峰、二倍体（2N）峰、四倍体（4N）峰区分很开，说明本实验检测精度高，CV值低。在Hochest散点图上即可清楚看到睾丸中所包含的各类生精细胞群：精原细胞P2（2N）、减数分裂期的精母细胞P3（4N）、减数分裂后的精子细胞P1（N），所谓看得到才能分得到，分析清楚保证了后续精母细胞P3(4N)的分选纯度。因此本实验可充分说明FACSAria SORP的高检测分辨率。
相关文献:
1. Expression of Immunoglobulin Gene With Classical V-(D)-J Rearrangement in Mouse Testis and Epididymis
Jing Huang, Li Zhang, Teng Ma, Pei Zhang, and Xiaoyan Qiu. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Volume 57(4): 339-349, 2009
Center for Human Disease Genomics, Institution of Basic Medical Science, Peking University, Beijing, People'Republic of China
简介：本文中研究人员将小鼠睾丸细胞用Hochest33342染色后，用BD流式细胞分选仪将小鼠睾丸中处于4N的精母细胞分选出10000个，之后抽提这精母细胞的RNA，并反转录cDNA，完成后续基因、分子、蛋白水平的研究。众所周知，精母细胞是比较脆弱的细胞，因此分选细胞用于抽提RNA必须要保证分选出细胞的高活性和高纯度，这篇文章对小鼠睾丸细胞进行倍体分析后（见图），仅分选出10000个精母细胞即实现了后续RNA的抽提，保证了后续基因、分子、蛋白水平的研究，充分说明了BD流式细胞分选的高活性和高纯度。
编辑: gaowei2010 作者:分子生物 流式技术 技术专题 碧迪 丁香园 丁香通
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