以4-MU（四甲基伞形酮）为底物定量检测ß-半乳糖苷酶(Gal)活性
1 应用说明
编码β-半乳糖苷酶(Gal)的基因已商业化地运用到报告基因研究的各种层面，重组的β-Gal已得到成熟的运用，以此用来研究启动子的功能、组织特异性表达、发育调控、mRNA的稳定性以及各种细胞器靶向蛋白的信号序列。应用β-Gal来测定启动子和基因的活性具有双重优点；检测方法简单，用于酶活性分析的底物容易获得，使用TBS-380微型荧光计对溶液中β-Gal活性进行检测时，其灵敏度和定量与荧光基质底物4-MU（四甲基伞形酮）相关。
2 应用原理
4-MU酯类只有裂解之后才能产生荧光。进行荧光素酶检测主要基于以下原理：首先要水解含有4-MU的底物，比如β-葡萄糖醛酸酶水解β-4-MU-葡萄糖醛酸或β-Gal水解β-4-MU-半乳糖。β-Gal水解4-MU-β-D-半乳糖产生的荧光分子4-MU，在365nm激发时能在460nm处产生发射光。
Turner BioSystems公司的TBS-380微型荧光计提供了灵敏而可靠的4-MU测定法。用标准10x10mm比色杯，TBS-380的线性检测范围为0.1nmol到750nmol或20 fg/mL 4-MU。微量检测皿适配器的灵敏度范围从1.0nmol到200nmol。
对15个稀释点三次重复测定的平均变量系数为3.5%。在4-MU检测中，重复测定中的变量应和光漂白及内在的波动相关。结果包括用微量检测皿和10x10mm比色杯的测量。
TBS-380微型荧光计的4-MU测定法
将4-MU系列稀释液的重复荧光检测结果进行平均、绘图。为了更高的精确度，用两个不同的校准值500nM和50nM产生了两个重叠曲线。两个曲线都显示有R2值，表明荧光值和4-MU浓度存在线性关系。TBS-380微型荧光计对4-MU的检测底线(MDL)是0.1nM，具有99.5%的可信度(Ziebold, 1967)。
3 所需器材
带有紫外激发模块的TBS-380微型荧光计(P/N 3800-003) ；10x10mm荧光比色杯 (P/N 7000-959)；微量适配器(P/N 3800-928)，可选 ；微量比色杯(P/N 7000-950) ，可选；4-MU，钠盐，MW=198.20 (Sigma, P/N 1508)；蒸馏水；无水碳酸钠，MW=105.99
4 4-MU溶液的制备
4.1 4-MU贮存液A(1mM)：19.8mg 4-MU（钠盐），MW=198.20；加蒸馏水至100mL；4°C避光贮存
4.2 4-MU贮存液B(1mM)：10 μL 4-MU贮存液A；加蒸馏水10mL；4°C避光贮存
4.3 碳酸盐终止缓冲液(0.20M)：2.12g无水碳酸钠，MW=105.99；加蒸馏水至100mL
5 实验方案
为了检测报告基因中的4-MU，产生β-Gal的细胞需先裂解并和合适的底物共同孵育。商业化的β-Gal报告基因检测试剂盒通常会有处理方案、组织特异的信号增强子和重组酶。大肠杆菌β-Gal在中性pH时活性最高，然而脊椎动物的β-Gal是溶酶体酶，在pH4.5的乙酸盐缓冲液中活性最高。孵育期缓冲液不会影响到TBS-380检测4-MU荧光值的灵敏度。
5.1 根据操作指导，将裂解细胞和4-MU底物共同孵育。所有样品同一时间内孵育，通常2min。
5.2 向100 μL细胞裂解液中加入1.9mL碳酸盐终止缓冲液，终止β-Gal的活性，从而制备检测样品。
编辑: muoquan
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