应用发光方法检测ATP含量
1.应用说明
三磷酸腺苷(ATP)存在于从微生物到高等动植物细胞所有的生物体中。ATP在细胞体内主要作用是提供能量,参与体内脂肪、蛋白质、糖和核酸的代谢,是机体能量的重要来源,在维持生物体的正常机能上有着无可替代的作用。ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可作为细胞活性的一个标志物。通过监测ATP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用。ATP也常作为微生物污染的一个指标，通过检测ATP含量，可以检测食品、水、啤酒、药品、化妆品等样品中的微生物含量，从而反应出其受污染的程度。
ATP检测可以用成色反应、荧光、发光或同位素等方法实现。采用发光方法检测ATP，具有更高的敏感性，而且简便、快速，是目前最为流行的方法。该方法基于萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）催化荧光素氧化，消耗ATP，发出光子的高效发光反应，具有发光效率极高、发光量与ATP含量呈很好的线性关系的优点。ATP是萤光素氧化反应中的限制因素，光的强度和样品中的ATP浓度成一定比例。在这种体系下检测到ATP的下限为0.1fm。（图 1）
图 1 采用具有发光检测功能的ModulusTM单管型多功能检测仪和ATP检测试剂盒所获得的标准曲线。用无ATP水稀释10μl标准ATP，而后加到100μl rL/L试剂的1.5ml离心管中。
Promega的ATP生物发光检测试剂盒与Turner的ModulusTM单管型多功能检测仪连用为ATP检测提供了一种快速、灵敏的方法，对于生成和降解ATP酶的研究来说，这是非常有用、可靠的方法。
当您打算用ENLITEN试剂盒检测ATP时，荧光素酶反应中的几个关键因素不容忽视。首先，rL/L最好在23-25℃、PH 7.73条件下反应。一些盐类和不解离的化学物质会削弱光的产生，因此，在样品制备过程中，缓冲液和ATP抽提试剂的选择要格外小心。另外您也能通过和标准品中检测到的相对光强度对比来核对ATP的污染情况。
在您的样品中，ATP或许会有不同的存在形式。比如，在细胞制备液中，ATP会在培养液中，在处理细胞时或许会改变培养液中ATP的量。
如果您希望检测微生物或细胞中的ATP，分析检测前肯定要先抽提ATP，那么就肯定要用到三氯乙酸（TCA），因为它能从细胞中释放ATP并能灭活降解ATP的酶。但同时TCA也会抑制萤光素酶反应，所以确定它的最佳用量非常重要。总体来说，0.5%-2.5% TCA（终浓度）对于细菌和真核细胞中ATP抽提是足够的。
标准曲线的制备对于正确分析样品中的ATP是非常有用的，所以标准曲线应该每天或有新的rL/L试剂被用时都应该制作，标准曲线中应该包含有用检测缓冲液稀释的不同浓度标准ATP，这种缓冲液成分应该与检测样品中的缓冲液一致。
2.所需器材
•ModulusTM单管型多功能检测仪（http://www.yph-bio.com/equip/modulus/modulus.asp）（货号 9200-001或9200-002）
•ENLITEN ATP检测系统中的生物发光检测试剂盒（货号：FF2000），里面有1瓶rL/L试剂，12ml 缓冲液，1瓶ATP标准样（1x10-7 M），25ml无ATP水
•可调的p1000移液器和枪头
•可调的p200移液器和枪头
•检测缓冲液
•1.5ml离心管
•试管架
•腈质、乙烯基质或乳胶手套
注：对乳胶过敏的人应用腈质、乙烯基质手套。
储存条件：rL/L试剂和配制的缓冲液需-20°C保存，ATP标准需-20°C保存。
编辑: yishuitan 作者:丁香园通讯员
以下网友留言只代表网友个人观点，不代表网站观点
