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焦磷酸测序

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发布日期：2012-09-18 15:17 文章来源：丁香园
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关键词： 甲基化 技术专题 欧易生物 丁香通 丁香园 　 点击次数：


焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点，是目前最理想的验证方法。因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。

欧易生物基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平台，应用焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术，不仅解决了常规的焦磷酸测序法在非CpG位点胞嘧啶转化为胸腺嘧啶时影响到引物的结合，进一步提高了结果的准确性；同时，给予的结果除了能准确定性检测到位点变化情况之外，还能精确地计算频率变化。

基本原理

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是由4种酶（DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。

每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。

ATP硫酸化酶催化PPi与5'-磷酰硫酸（APS）结合形成ATP，然后在荧光素酶的催化作用下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。CCD感应器检测到光信号后，Pyrogram转化为检测峰，每个峰的高度（光信号）与掺入的核苷酸数目呈正比。

Apyrase不断降解未掺入的核苷酸和ATP，淬灭光信号，再生反应体系，以此得到整个结果。





PyroMark流程：

 


结果展示：

 

    

 


技术优势：

先进的算法设计可优化最佳的实验条件，内嵌式的质控保证数据的准确可靠，全程的软件控制减少人为因素的影响；


灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至包括测序的引物区域；

周期短、通量高，1h内可同时平行分析96个样本，一次运行可实现多个连续CpG位点定量分析；

除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化；

对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人类基因组的所有CpG位点；

对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本；

案例分析：

Pyrosequencing技术检测宫颈癌中UTF1启动子区域甲基化水平

研究者利用illumina HumanMethylation27芯片对9例样本（4例正常，5例宫颈癌）进行全基因组启动子区甲基化扫描，结果显示宫颈癌患者UTF1启动子区域呈现出高的甲基化状态。为了验证芯片筛选的结果，采用焦磷酸测序方法首先对这些样本的UTF1启动子区域进行深入分析，结果表明正常宫颈中UTF1启动子区域呈现低甲基化状态，而相同的位点在SCC中呈现高甲基化状态。为了进一步验证，研究者扩大样本量，对47例不同类型的石蜡包埋组织样本及10例白细胞进行焦磷酸测序检测，与之前的结论保持一致。结合RNA水平和蛋白水平的实验，研究者最后提出UTF1启动子甲基化状态可以作为宫颈癌诊断的一个重要的分子标志物。

原文：Aberrant Promoter Methylation and Expression of UTF1 during Cervical Carcinogenesi. Plos One. 2012 Aug.


    
焦磷酸测序检测四种不同类型样本中甲基化状态

编辑: gaowei2010

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