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BSP检测技术
亚硫酸氢盐处理后测序(bisulfite sequencing PCR,BSP)法是检测基因甲基化的经典方法,其原理为:用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)而甲基化的胞嘧啶则不变。
基因组DNA经亚硫酸盐处理后,设计BSP引物扩增目的片段,此时尿嘧啶(U)全部转化为胸腺嘧啶(T),最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。
BSP实验流程:
引物设计及注意事项:
引物设计软件:Methyl Primer Express v1.0
引物设计注意事项:用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理,将未甲基化的C碱基转变为U碱基,而甲基化的C碱基不变,从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异,所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意:
1、引物设计不能含有CpG位点,以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。
2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点,BSP扩增片段长度300-500bp,包含的CpG位点越多则引物的打分越高。
BSP服务完成时提供:
Bisulfite处理的基因组DNA;
实验报告(包括BSP产物的直接测序报告)。
结果展示:
BSP测序图
BSP点状图
空点表示为发生甲基化的CpG位点,实点表示发生甲基化的CpG位点
BSP柱状图
案例分析:
利用二代测序和BSP(bisulfite sequencing PCR)研究MLH1 启动子区域甲基化状况在肿瘤内部的异质性
同一肿瘤中可能包含不同体细胞变异的细胞,过去对肿瘤的这种异质性研究主要集中在遗传学领域,作者则将目光锁定在表观遗传学方面。研究人员先利用二代测序手段,对来自33个样本(包括子宫内膜癌,相应的外周血以及正常的子宫内膜组织)的1000个分子的MLH启动子区域的甲基化谱(spectrum of MLH1 promoter methylation)进行研究,后续再利用BSP手段进行验证,发现了不同的子宫内膜癌细胞MLH1启动子区域出人意料的甲基化异质性形式,这种高分辨率的研究手段能够研究肿瘤甲基化的克隆性(clonality of methylation)从而对肿瘤发生过程中对启动子区域异常甲基化的状况进行研究。
BSP验证二代测序
原文:Intra-tumor heterogeneity of MLH1 promoter methylation revealed by deep single molecule bisulfite sequencing,Nucleic Acids Research,2009.
编辑: gaowei2010