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基于血液样本的用于检测或诊断的DNA甲基化biomarkers研究策略

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发布日期：2012-09-19 08:54 文章来源：丁香园
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关键词： 甲基化 技术专题 欧易生物 丁香通 丁香园 　 点击次数：


利用血液样本进行DNA甲基化生物标志物的筛选面临的问题非常基础：血液中cfcDNA的浓度很低，5-10ng/mL，已有的检测手段只能检测到极少的基因。研究者往往会采用外周循环血单核细胞（PBMC）进行研究，从而绕开这个问题；或者如果使用cfcDNA进行检测，也只是对其中少数特定基因进行分析。但是PBMC中异常的甲基化与初级肿瘤的联系并没有建立，而且对特定基因的选择存在人为偏好性，这些都使得利用cfcDNA甲基化标志物的开发受到限制。

下图是三种基于血液检测的生物标志物筛选策略：

 


 


策略a：

利用去甲基化试剂处理，分析重新表达的基因。这里需要无偏向性的鉴定出重新表达的基因，因此首先需要使用培养的细胞系而不是肿瘤组织。选择哪些受甲基化调控的基因进行研究，具有较大的主观性。此外，这种技术并不能鉴定在癌症细胞中被甲基化但是经过去甲基化试剂处理之后该基因表达并没有改变的基因。

首先，选定合适的细胞系，利用去甲基化试剂处理，选定候选基因，然后在肿瘤组织中进行验证，最后在血浆中验证。在这种策略中对三种实验材料进行研究，希望在细胞中研究得到的biomakers能够在血浆中得到验证。

策略b：

省去在培养细胞中筛选差异表达基因一步，直接从研究比较深入的肿瘤组织开始，筛选出差异甲基化位点之后在血浆中进行检测。Epigenomics公司利用这种策略开发了结直肠癌中基于血浆检测的生物标志物。一共检测到3个片段，其中一个片段在SEPT9基因的启动子区域，在临床试验中具有67%灵敏度及88%特异性。这种技术相比于之前的检测技术好很多，但是仍然有33%的癌症病人未检测到，还有12%的健康人被误诊。此外，SEPT9异常甲基化在乳腺癌、子宫癌、颈脖癌及其他肿瘤中也能够被观测到，说明单基因的生物标志物可能不是最优选择。

SEPT9的不尽人意说明“从组织到血浆”的策略存在缺陷，研究表明在肿瘤中和血浆中甲基化模式相似，但并不完全一样。说明在肿瘤组织中的biomarkers可能并不适用于血浆检测。

策略c：

直接用血浆来进行全基因组甲基化分析并且筛选biomarkers是最优的选择，但是一直以来面临的难点是血浆中DNA浓度很低，每毫升血浆中只有几ng的cfcDNA。随着检测技术的不断改进，目前已经有相关技术能够对微量的DNA进行甲基化检测。最近开发的一种技术将亚硫酸氢盐转化与全基因组扩增结合起来（qMAMBA），虽然这种技术进行基因组水平研究还有待验证，但是从目前已经鉴定出的5个片段来看，这种技术可以用于全基因组分析。另一种技术，MethDet,利用甲基化敏感的限制性酶对未甲基化片段进行酶切。这种技术基于cfcDNA可以用于检测或区分不同疾病。

编辑: gaowei2010

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