宁琴教授：从肝细胞死亡的发生机制认识重型肝炎的分子免疫治疗
注：文字内容来自会议光盘
华中科技大学同济医学院附属同济医院感染性疾病研究所 宁 琴
一、肝细胞死亡的发生机制
肝细胞死亡超过了肝脏的再生能力，即会发生肝衰竭。经典的肝细胞死亡模式分为两类，即坏死与凋亡。坏死往往继发于各种肝损伤所导致的ATP 耗竭，细胞肿胀溶解，导致胞内容物的释放和继发性炎症反应的发生。凋亡为ATP 依赖的程序性细胞死亡方式，其细胞因皱缩而独立出来，染色质固缩，DNA 断裂成规律性片段，并被胞膜包绕形成凋亡小体，后者可由邻近巨噬细胞吞噬，以最大限度的减轻细胞内容物的渗漏和炎症反应。长期以来，坏死与凋亡被认为是两种截然不同的现象，但在肝脏病理中我们可以观察到肝细胞的坏死与凋亡是并存的。研究证据提出新的观点，坏死与凋亡是源于相同启动因素和信号转导途径的不同的细胞死亡方式，这一过程被命名为坏死性凋亡。
细胞肿胀是坏死早期最为显著的特征。在ATP 耗竭后，肝细胞骨架蛋白的形态结构发生改变，促成浆膜大泡的形成。随即出现以线粒体去极化、溶酶体破裂、双向阴离子荧光团泄漏及浆膜大泡肿胀加剧为特征的亚稳态。该状态持续几分钟后浆膜大泡破裂，导致浆膜渗透压屏障不可逆的损伤，各种跨膜电子、离子梯度的断裂，以及溶质酶和代谢中间产物的渗漏，最终细胞失去活性。与其它高需氧的组织器官类似，肝脏对供血不足引起的损伤极为敏感。其中低流量性缺血，即血供被完全阻断时，整个肝脏将处于缺氧状态。而低流量性缺氧，即仍有血供但不足以满足氧需时，肝小叶中央区域而非周边区域将发生缺氧。由于肝脏具有双重血供系统，由低流量性缺氧造成的中央区域肝细胞的坏死是更为常见的现象。
缺血-再灌注损伤发生于肝脏的缺血-再灌注损伤可分为两个阶段，第一阶段反映了直接的肝细胞损伤，第二阶段则涉及到天然免疫系统的激活，特别是缺血后肝脏枯否氏细胞的活化，以及中性粒细胞、淋巴细胞的炎性浸润。目前认为，当缺血、缺氧发生时，由于ATP 通过氧化磷酸化途径的合成障碍，肝脏细胞基本丧失活力，但随之发生的酸中毒会使细胞的坏死延迟数个小时，直至再灌注完成后，组织的pH 值恢复正常，细胞即发生肿胀坏死。多项研究表明，在经历热缺血或冷缺血后，肝细胞与内皮细胞对pH 值依赖的坏死途径极其敏感。在肝细胞的体外热缺血-再灌注损伤模型中，通过共聚焦显微镜观察到在pH 值修复后，大量MPT 通道被诱导开放，线粒体发生严重肿胀。随后在Caspase 级联反应激活之前，ATP 即已耗竭并引发肝细胞急剧肿胀坏死。体内肝脏发生缺血-再灌注损伤后，其急性阶段也主要表现为肝细胞的坏死，组织学评价凋亡细胞的发生率仅为2%。但也有其他的观点认为缺血-再灌注损伤后，肝细胞的凋亡和坏死是并存的，损伤的强度和持续时间决定了细胞的死亡方式，即严重的损伤会导致早期发生的肝细胞坏死，而轻度的损伤则发生延迟的凋亡反应。
免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死。肝细胞的广泛坏死、网状支架塌陷及大量炎性细胞浸润是重型病毒性肝炎的主要病理学改变，此外其肝窦及血管腔内广泛微小血栓的形成也是值得我们关注的又一病理生理学特征。本研究组即针对这一特征经过深入系统的研究，克隆到与微循环障碍和肝细胞坏死密切相关的新的凝血酶原酶分子---fgl2 凝血酶原酶。fgl2 凝血酶原酶属于纤维蛋白原超家族，由活化巨噬细胞或内皮细胞产生，可直接催化凝血酶原转变为有活性的凝血酶，从而快速启动凝血过程，促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血栓形成。研究发现fgl2 凝血酶原酶在人或小鼠重型病毒性肝炎的外周血PBMC 和肝组织中均有特异性的高表达，并与疾病的严重程度正相关。提示活化巨噬细胞（内皮细胞）/fgl2凝血酶原酶介导的免疫凝血途径可通过促进肝脏纤维素沉积和微血栓形成引发肝脏的微循环障碍，最终肝细胞缺血缺氧，ATP 合成障碍而触发肝细胞坏死的发生。至此，fgl2 凝血酶原酶的发现和相关研究对重型病毒性肝炎肝细胞坏死的分子机制提出了全新的见解，也为指导临床预测患者转归、判断治疗效果，开辟新的药物和基因治疗途径提供了理论基础和靶目标。
2. 凋亡
凋亡的触发分为外源性途径和内源性途径，均通过激活Caspase 级联反应来启动凋亡程序。死亡受体/配体通路在凋亡诱导的外源性途径中占有重要地位，以DNA 损伤、p53 基因激活为代表的氧化应激反应则是内源性凋亡途径的始动因素。死亡受体属于肿瘤坏死因子/神经生长因子受体超家族，为包括胞外配体结合区域、跨膜区域和胞内死亡结构域三大部分的跨膜蛋白。目前认为在肝脏发挥重要作用的死亡受体主要包括Fas、TNF-R1 、TRAIL-R1/ TRAIL-R2 等，后者与相应的配体FasL、TNF-α 和TRAIL 结合后可诱导受体发生寡聚化并激活，其胞内的死亡结构域与相应的连接蛋白相互作用进而触发凋亡的级联反应。
Bcl2 家族蛋白，包括促凋亡因子与抗凋亡因子，是控制线粒体释放致凋亡因子的主要调节因素。作为Bcl-2 家族中促凋亡BH3-only 蛋白亚类的成员之一，Bid 蛋白在胞浆可被Caspase8 酶切激活形成tBid 并转位至线粒体，最终通过含多个死亡区域的促凋亡因子Bax/Bak 直接与线粒体作用，影响其外膜的通透性、细胞色素 C 及其它促凋亡因子的释放，诱导细胞凋亡的过程。抗凋亡因子诸如Bcl-2、Bcl-xL 及Mcl-1 等则可能通过与Bax 及Bak 形成异源性二聚体阻断凋亡效应的发生。
2.1 Fas/Fas-L 途径
Fas 在肝细胞具有广泛的表达，主要定位于高尔基复合体及其反面的网络结构。在经历毒性物质如胆汁酸刺激后，大量Fas 会转位至肝细胞浆膜。人或小鼠肝细胞在给予拮抗性Fas 抗体后会出现大面积的凋亡。在暴发性肝衰竭患者中，亦可观察到肝细胞Fas 的强阳性表达，肝脏炎性浸润淋巴细胞、外周淋巴细胞上Fas-L 及血清可溶性Fas-L 水平的大量上调。体外研究表明，增加的铜载量可诱导肝细胞的凋亡，而抗Fas-L 中和性抗体能起到一定的干预作用，提示了Fas/Fas-L 途径在Wilson’s 疾病中的作用。在HELLP 综合征（溶血、肝酶升高和低血小板计数）中，有证据发现源于胎盘的Fas-L 是诱导肝损伤的始动因素。此外，Fas/Fas-L 途径在酒精性肝炎、多种药物诱导的急性肝衰竭的发生发展中亦占有重要的地位。
2.2 TNF-α/TNF-R1 信号
正常肝细胞中TNF-R1 的表达水平很低，但各种急慢性肝脏疾病中，TNF-R1 会在肝实质细胞、血窦内皮细胞和炎性浸润细胞中大量表达。TNF-α 信号途径与Fas-L 信号途径具有交叉重叠之处，包括Caspase8 的激活、Bid 的切割以及细胞色素C 的释放等。不同之处在于除了诱导凋亡途径，TNF-α还能通过核转录因子κB（NF-κB）依赖的基因表达途径促进肝细胞的增殖，在肝细胞的再生中起重要作用。研究表明，NF-кB 可通过下调c-Jun 氨基端激酶（JNK）与激活蛋白1（AP-1）来抵御TNF-α 诱导的凋亡反应。TNF-α 诱导产生的活性氧簇则具有抑制JNK 钝化磷酸酶的功能，可促进JNK 途径的持续活化，细胞色素C 的释放及Caspase3 的激活。抗氧化治疗能够阻断TNF-α 诱导的暴发性肝衰竭，但不影响肝细胞的再生功能。目前关于TNF-α 在人与小鼠暴发性肝衰竭发生发展中的作用已有相当的阐述， TNF-α 被认为是缺血性肝损伤中肝细胞凋亡的重要诱导因素。在酒精性肝炎患者中，其血清中TNF-α 与TNF-R1 的水平亦显著升高并与患者死亡率相关。
编辑: yang 作者:宁琴
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