核酸抽提的基础(二)
E 后续酶反应失败
资料书中连篇累牍的原因我就不说了,因为都对。我相信因为大家首先相信的就是它们,所以碰到问题首先一定会从那些方面着手。如果三次实验后,问题还没有解决,那么 90% 的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀,可以陆续“杀”死很多酶;大分子物如蛋白质,像绳子,只能“捆住”一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。
F 蛋白质是如何残留的
PC 纯化:a-取上清时取到中间层及下层;b- PC 用量不足;c-混匀不彻底;d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。
高盐沉淀:a-取上清时取到了蛋白沉淀;b-裂解不彻底;c-裂解液用量不足,使裂解体系太粘稠;d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。
介质:a-裂解不彻底;b-裂解体系太粘稠。
G 小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的
醇沉淀:洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。
介质:颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致,极少数由操作者未严格按要求操作所致。
10、某些我使用的操作手法
实验做多了,的确希望能偷点懒;偷懒也有讲究,否则就是偷鸡不成失把米。下面就是一些在确保抽提成功前提下的通用操作方法;有些看起来很麻烦,但请想一想抽提失败后的再次抽提,应该是可以算偷懒的方法了:
I:混匀操作 (1.5ml 离心管内) – 如果液体体积在 100ul 以内,用指头弹击尖底混匀;在100-400ul 之间,用振荡器混匀;大于400ul,用手晃动混匀:晃动时使离心管底永远处于斜上位置,频率要快。
II:PC 抽提时上清的移取 – 离心管倾斜,根据上清的量选择不超过 200ul 的移液器,在外面先压下移液器,再将 tip 移入上清。Tip 要尽可能靠近液面,tip 的尖嘴接触内壁,缓缓松手吸取上清。可多次移取,但决不要使用 1ml 移液器。
III:核酸的洗涤 – 核酸沉淀后离心,将上清倒掉。如果核酸是来源于杂质比较多的样品 (如植物、动物肝脏、细菌等),则在加入 75% 乙醇之前,再将离心管短暂离心后,用移液器将残留液体彻底吸出,否则,75% 的乙醇非常容易将残留液体中的多糖等杂质给沉淀下来。移取 75% 乙醇使用一次性的塑料吸管,加入后将核酸彻底悬浮起来,置于室温一段时间 (时间长短取决于沉淀大小),期间多混匀几次。如果去除 75% 乙醇的操作是“离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体”,则洗涤 2 次;如果去除 75% 乙醇的操作是“离心后倒掉”,则洗涤 3 次,但最后一次仍然采用“离心后倒掉再短暂离心后吸出残留液体”。这样洗涤的目的,是确保小分子物的残留低于 10 万分之一 (最大残留不高于 10uM 级)。
11、一些特别的问题
a:EP 管的问题
几乎没有人会认为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关,与某些现象 (如核酸在 -20C 保存一天后发生了降解) 有关系,但事实是,EP 管的质量的确与核酸抽提的质量以及核酸保存时的稳定性有关。
硅化可以提供最高质量的 EP 管,使某些奇怪的现象消失或者大大减轻。最糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力,在倾倒液体时残留多,核酸在管中保存的过程中会发生变性。这样的管子是很有市场的,因为便宜;而正因为便宜,其材料总是不令人放心的。
编辑: ludongcn 作者:上海孤儿