单细胞基因组学篇
单细胞基因组学背景和概念
细胞是生物学的基本单位，细胞个体之间，甚至具有相同遗传背景的体外培养细胞个体之间也是不尽相同的，不同细胞在酶活性、基因表达和细胞信号转导方面有很大的差异。因此，随着对细胞研究的逐渐深入，科学家们开始解析单个细胞的行为。
单细胞基因组学
单细胞全基因组测序和以单细胞和微量细胞为材料的全基因组范围内的基因功能研究。
单细胞测序是指在单个细胞水平上对基因组进行扩增与测序的一项新技术。在微生物生态学、癌症基因组、法医学、微量诊断、遗传印记等研究中，单细胞微量测序技术使其研究和检测更深入更细致, 从而带动基础科学新的发现, 也将给人类对抗疾病、保障健康和提高生命寿命和质量带来很多新的机会。
流式细胞仪分析分选单个细胞
单细胞基因组必然要分析单个细胞， 传统单细胞分离方法和缺点：
（1）有限稀释法，但连续稀释容易损失细胞，难于从复杂的微生物样本中分离细胞；
（2）显微镜分离法，显微操作其极低显示单细胞限制了广泛使用；
（3）激光捕获显微切割，其中显微切割由于不精确的切片杂质使遗传物质损失；
（4）免疫磁珠分离纯度不够，无法精确分离；
（5）微流体，无法结合多参数同时分析，通量低。
流式细胞仪的分析分选功能正好能够解决其样本制备的难点。流式细胞术已成为单细胞分离的首选方法，因为它是高通量和有能力进行多参数检测（如大小，粒度，内在的或外在的荧光）。在高速流式细胞分选仪器上同时具有进行生物分类性能评估的多参数检测和分选特定细胞的能力。
流式分选＋单细胞测序流程：
组织或其他来源的细胞群体标记特异性荧光，经流式分选出单个的目的细胞到孔板后，进行单个细胞dRCR再测序。
1.1单细胞测序研究肿瘤进化
摘自：Tumour evolution inferred by single-cell sequencing
Nicholas Navin, Jude Kendall NATURE | VOL 472 | 7 APRIL 2011
文章介绍了从肿瘤细胞中分离单个流式分选的核，接着进行全基因组扩增和单细胞基因组的测序，以研究肿瘤发展。
图释： 多基因组乳腺肿瘤分析100个单个细胞。a, T10被分为12块，其中六个提取出核后，用流式依据倍体分选单个核。FACS显示了4种不同的倍体(F1-F4)。 b, 邻接法构建的进化树显示了4种主要的进化群。c, 系统发育树 的结果一致，显示了共同的前体和群之间的进化分歧，下面显示的是单个细胞的拷贝谱，圆形分格统计图表显示了组成每群细胞的比例。
1.2 通过流式细胞仪分选出处于不同发育时期单细胞胚胎进行小RNA差异化分析
摘自：Large-scale sorting of C. elegans embryos reveals the dynamics of small RNA expression
Marlon Stoeckius1, Jonas Maaskola1 et al. nature methods vol.6 No.10 october 2009
发育生物学早期研究采用基因敲除观察形态发生的方法，现在的深度测序、蛋白质组学可以定性蛋白质组学、蛋白之间的相互作用生物发育的全面了解需要对基因进行解读，目前常用的方法是，用化学药物将胚胎发育阻断在某个阶段，但这些方法都不特异，为不同阶段胚胎的混合体。
流式技术可以进行特定阶段单个细胞分选，是其他高通量基因分析和分子生物学检测方法所不能比拟的优势。流式分选出早期单个细胞胚胎后，分析其小的非编码RNA的动态表达谱，从早期根本上揭示胚胎基因组学。
线虫是研究胚胎发育的模式工具，使用FACSVantage建立了eFACS分选方法，得到高纯度的1-cell stage线虫胚胎、2-4-cell stage线虫胚胎和晚期胚胎。分选后的细胞进行小RNA（包括microRNA）的分析，比较不同发育阶段的胚胎的小RNA的差异。
图释：BD FACSVantage分选出数以万计的纯度至少为98％的1个细胞阶段的胚胎。（a）自发荧光信号和绿色荧光信号的散点图中是通过流式细胞仪检测混合胚胎阶段中OMA-1-GFP融合蛋白的表达；显示10,000胚胎的混合阶段。分选高GFP阳性信号的1个细胞期胚胎（绿色;占全部的3-7％，*），得到富含1 个细胞期胚胎样本（?70％）。 （b）再次分选高GFP阳性（绿色，占一次分选后的70％; **）。得到高纯度（>98％）1 个细胞期胚胎的样品；2000胚胎显示。（c）一个随机挑选的96 个流式分选1 ??个细胞期胚胎样品用显微镜分析。 DAPI染色原核显示为黑色。图片显示通过第一个细胞周期时胚胎的进展情况。比例尺，25um。 （d）RT-PCR分析一次分选后胚胎、再次分选后胚胎和分选前的混合胚胎。在再次分选胚胎中，1 个细胞阶段胚胎中检测到特异性标记基因OMA-1和OMA-2，而基因的med-1和end-1（4-8-细胞阶段）未检测到。在一次分选胚胎中med-1和end-1都可以检测到。Act-1也用RT-PCR检测。
1.3 单细胞核测序技术（SNS）
摘自：Genome-wide copy number analysis of single cells
Timour Baslan, Jude Kendall et al .VOL.7 NO.6 | 2012 | nature protocols
图释：步骤一来源于细胞系或组织中细胞核的准备流式分选；步骤二 分选单个细胞到96孔板；步骤三WGA单核细胞DNA扩增，纯化，定量；步骤三 超声波破碎收集WGA DNA；第四步骤准备lllumina库和测序。BD FACSAria分选单个细胞。
编辑: gaowei2010
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