BEAMing技术（数字PCR-流式技术）
数字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)作为DNA定量的新技术，实现了单分子DNA绝对定量。dPCR是将单个DNA样品反应液分别进行数以百计的反应，并且每个反应分别进行扩增检测. 此技术在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的研究发挥了重要作用。
BEAMing技术：结合了数字PCR以及流式技术，最早是由Bert Vogelstein提出。其方法是每一类DNA分子都会专一的与磁性珠相连接，然后DNA分子之间的差异可以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。这种方法是基于小珠(Bead)、乳浊液(Emulsion)、扩增(Amplification)、磁性(Magnetic)，这四个主要组分来构建的，所以被称作为BEAMing。
BEAMing技术应用优势：
（一）在常规实验室条件下，数以万计的DNA分子可以通过该种方法来进行评估。
（二）特异的突变可以通过流式细胞仪进行分离筛选以备进一步分析和研究。
（三）BEAMing技术可以用来对特定组织或者人群中罕见的突变，以及研究一般基因序列或转录的产物的变异都可以提供相应的鉴别和定量分析。
BEAMing技术步骤
步骤1：包被链霉亲和素磁珠共价键结合的生物素标记的寡核苷酸（寡核苷酸）。
步骤2： PCR所需的所有成分和结合引物微球和模板DNA的水油溶液混合一起搅拌，创造微乳液。（水为白色小室，灰色为油）包含平均小于1个模板分子和小于一个微球。红色和绿色的模板代表两个模板分子，其中不同的一个或多个核苷酸的序列。
步骤3：微滴乳状液进行的常规PCR温度循环。如果DNA模板和微球在一个单一的水隔室中一起存在，微球结合的寡核苷酸作为引物进行扩增。连接到微球直标红色和绿色的线代表从两个不同的种模板的延伸产物。
步骤4：磁性分离微球（微球有磁性）。
第5步：变性后，将微球孵育能够区分不同种模板的序列的寡核苷酸。然后荧光标记的抗体，用于标记绑定的杂交探针。激光激发后含有PCR产物的微球能够发出红色或绿色。
步骤6：流式细胞仪是用来计数的红色和绿色的微球。
FACS分析实验的具体方案见文献 BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions
Frank Diehl, Meng Li NATURE METHODS | VOL.3 NO.7 | JULY 2006
基因序列的变异检测
摘自:Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors
Frank Diehl, Meng Li et al. PNAS _ November 8, 2005 _ vol. 102 _ no. 45
BEAMING方法分析癌症的早期中循环DNA中突变数目。
图释：（A）修改后的BEAMing的步骤（B）微球的扩展段单个碱基扩增。正常DNA序列在可疑位点碱基是G,突变序列是A,分别结合不同的荧光。
图释：流式细胞仪分析BEAMING获得的数据。（A）前向角和侧向角散射光点图分出单个微球群体。（B）PE信号微球直方图显示进行。（C）点图显示PE-阳性微球门中Cy5和FITC微球，分布在三个不同的种群红色、绿色、蓝色的微球。流式分别分选三种微球序列，分析表明，红色和绿色微球分别含有野生型和突变型序列，蓝色微球中是野生型和突变型序列的混合物。
DNA甲基化检测
DNA甲基化(DNA methylation)是指由DNA甲基转移酶介导，在胞嘧啶的第5 位碳原子上加上一甲基基团，使之变成5 - 甲基胞嘧啶(5 - mC)的化学修饰过程。
DNA甲基化作用： DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
检测方法
在目前有关甲基化的研究中,以亚硫酸氢钠预处理法应用最为广泛。
亚硫酸氢钠预处理法：（一）亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法；（二）引物延伸反应界导的甲基化分析法(单碱基延伸,甲基化特异性PCR 和实时PCR) ；（三）亚硫酸氢钠预处理DNA 的PCR产物的测序分析和流式细胞仪的检测(methyl-BEAMing)。
流式检测DNA甲基化的原理图(methyl-BEAMing)
临床样本定量DNA甲基化
摘自：Sensitive digital quantification of DNA methylation in clinical samples
Meng Li, Wei-dong Chen et al. VOLUME 27 NUMBER 9 SEPTEMBER 2009 nature biotechnology
图释：流式获取DNA甲基化-BEAMing的典型图谱。微球的数目代表了甲基化的波形蛋白，非甲基化波形蛋白以及他们均含有的微球和处于左下角的阴性微球。阴性微球代表水溶液中不包含模板分子的纳米舱。
编辑: gaowei2010
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