流式-荧光原位杂交(Flow-FISH)
流式荧光原位杂交(Flow-FISH)：
源于荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术，首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置，最后结合流式细胞仪来检测。
端粒长度检测
端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，实质上是一重复序列，作用是保持染色体的完整性。细胞分裂一次，由于DNA复制时的方向必须从5'方向到3'方向，DNA每次复制端粒就缩短一点，所以端粒其长度反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。
端粒DNA主要功能
第一，保护染色体不被核酸酶降解；
第二，防止染色体相互融合；
第三，为端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。
主要检测方法：
DNA印迹法(Southern blot, SB)：使用限制性核酸内切酶消化DNA, 然后琼脂糖电泳分离不同大小的片段, 转移到硝酸纤维或尼龙膜上。用同位素或生物素、碱性磷酸酯酶标记的端粒特异探针与其杂交。 末端限制酶切片段(TRF)通过光密度计定量测量。
杂交保护分析法(hybridization protection assay, HPA) ：需要制备基因组DNA、细胞或组织溶胞产物同吖啶酯(AE)标记端粒的探针进行杂交, 检测发光强度, 确定端粒在Alu序列中比例。
荧光原位杂交(FISH)：FISH直接将寡核苷酸探针标记在端粒序列上. 标准的FISH包括制作分裂中期的染色体以及DNA变性, 与FITC或Cy3标记的寡核苷酸探针杂交, 用DAPI或PI复染, 最后用荧光显微镜检测信号。
流式-荧光原位杂交(Flow-FISH)：包括6个基本步骤: 细胞分离, DNA变性并与PNA探针杂交, 洗去多余探针, 复染后用流式细胞计量术采集和分析。
Flow-FISH测量端粒长度原理：用荧光素标记的核酸-(CCCTAA)3端粒序列特异性探针进行FISH后经流式细胞仪检测，其荧光强度的高低可反映端粒的长短。
流式检测端粒酶长度
摘自：Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH)
Gabriela M Baerlocher et al. VOL.1 NO.5 | 2006 | NATURE PROTOCOLS
图释：从正常志愿者（83岁）有核血细胞的流式FISH分析。每群核细胞都分析两个样本：一个细胞与核算探针(PNA)杂交(c)，另一个的处理方法与前者相同，但不与PNA杂交(b)。后者是为了检测细胞的自发性荧光，以便进行端粒长度的计算(g)。细胞与非饱和浓度的DNA染料LDS751、各种抗体 (CD45RA-Cy5和 CD20-PE) 进行染色。分析：首先，在FSC/SSC (d)图中细胞圈为R4 and R5，再显示在 FSC/LDS751图中(a)，将细胞分为3群，甲醛固定限制了小牛胸腺细胞的与LDS751的染色，从而将它从R4的淋巴细胞群中区分出来，绿色荧光细胞(c) 和 (b)显示的分别是(a) 和 (d)圈门后的细胞与PNA杂交和未杂交的结果，直方图显示就是(g)。CD45RA 与 CD20 是用来圈出特异性的细胞群分析其端粒长度。
图释：由Flow-FISH计算端粒长度。直方图显示的绿色是未结合 (PNA) 探针，红色的是标记了探针的细胞，每个病人3群细胞。每个病人的flow FISH中采用2个对照：内对照 (固定的小牛胸腺细胞，最上面的直方图)和人体样本参考对照 (左侧样本的粒细胞)。参考对照纯化粒细胞的端粒长度用Southern blot分析所得，其平均TRF长度用来计算每群细胞的端粒长度：其特异性的荧光强度为红色部分的荧光强度减去绿色部分的自发性荧光。然后根据已知参考对照的TRF和其特异性荧光强度，计算每群细胞的端粒长度。由于引入了对照细胞特异性端粒的荧光强度，以及每个病人参考细胞的特异性端粒荧光，降低了待测样本端粒长度的估计错误。
染色体重复序列的检测
Flow-FISH检测染色体中重复序列，结合染色体信息分析不同遗传背景DNA的重复序列、卫星序列，分析细胞的同源性、检测卫星序列的不稳定性。
摘自：Analysis of repetitive DNA in chromosomes by flow cytometry
Julie Brind'Amour1 & Peter M Lansdorp VOL.8 NO.6 | JUNE 2011 | nature methods
图释：人和小鼠细胞系的染色体和卫星DNA的等位基因特异序列的分析。 (a,b) Hoechst 33258/ chromomycin A3双参数图：C166 鼠染色体与卫星PNA探针 (5′-Cy5-GACGTGGAATATGGCAAG-3′; a) 杂交，人纤维肉瘤HT1080细胞系染色体用L1.84卫星 DNA 的PNA探针(5′-Cy5-GAGAATTGAACCACCG-3′; b)进行杂交。18号染色体的数据用红色显示(c)为 Cy5荧光强度直方图 ，背景荧光(*)，18号染色体的两个峰分别标记为**和 ***。 (d) 用L1.84探针与HT1080 杂交图。
编辑: gaowei2010
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