荧光检测灵敏度MESF的测定
通常使用Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome（简称MESF）来定义流式细胞仪的检测灵敏度，我们用可检测到每个微球上荧光分子数目，来定义和衡量流式细胞仪的检测灵敏度。一台灵敏度高的流式细胞仪可有效检测出低丰度表达的群体，并可有效收集弱荧光信号，保证实验结果的高度精确性。通过对BD FACSAria系列仪器灵敏度进行测试均达到市场同类产品中最高标准。
实验数据
图1. 使用校准微球实测荧光强度
上图中使用校准微球实际测量出FITC、PE荧光通道中每个荧光峰值的平均荧光强度，通过校准微球说明书中的各峰所对应的MESF标准值及线性回归方程计算出实际测量的MESF值。
结果讨论
以488nm激光器为例，实测检测灵敏度：FITC - 6 MESF，PE - 5 MESF。此结果高出国家质检部门所出具的质检结果报告，并远远高于市场同类产品。
图2. 医疗器械质检中心出具的MESF检验报告单
对于依赖于荧光信号检测的实验样本或相关研究来讲，高灵敏度好分辨率是至关重要的，就好比我们看到以下的花粉图像，图像的细节我们没有办法完全捕捉到，可能会漏掉一些关键的信息，就好比用分辨率参数低的机器去检测标本，是无法检出弱表达信号或者低阳性率的样本的，更没有办法将细胞拿出来做下游实验。
图3. 灵敏度与分辨率的重要性
BD首创的在光学系统方面的能有效的最大化检测信号，并在多色检测中极大的提高每个颜色通道的灵敏度和分辨率，增强的灵敏度和分辨率意味着即使信号很弱的细胞群也可以轻易的识别和分选。
人类乳腺癌SP细胞（百分之一含量）
肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量肿瘤细胞，具有自我更新能力和分化潜能，是肿瘤增殖生长、转移和复发的根源，肿瘤干细胞已成为肿瘤研究的热点。由于组织及细胞存在巨大差异，到目前为止尚未找到肿瘤干细胞的特异性标志。不过干细胞的另一种特性(高效外排DNA染料Hoechst 33342)也可以用来分离具有干细胞特征的细胞,采用此方法可以分离出一小部分侧群(side population,SP)细胞。现已在多种类型的肿瘤组织和细胞系中分离出SP细胞（如乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤等）,并证实SP细胞具有许多与干细胞相似的特征,这些都提示SP细胞中富含肿瘤干细胞,
近年来，通过流式细胞仪分选SP细胞的方法在肿瘤干细胞研究中越来越受到重视，诸多顶级刊物如《Nature》等顶级杂志上已有大量SP细胞研究的文章发表。流式细胞仪在该研究中起着关键作用。通过流式分选得到的SP细胞纯度可达98%以上，同时能保证较好的细胞活性，分选出的高纯度SP细胞可以用于后续的免疫标记及分子生物学研究。
图4. 乳腺癌SP细胞流式图谱。人类乳腺癌SP细胞利用Hoechst33342标记，在装有375激光器的Aria上采集数据并进行分选。SP 细胞含量约1.2%,分群清晰，S 期及四倍体细胞清楚，分选后细胞回测纯度高达99%。
人类肿瘤干细胞（十万分之一含量）
肿瘤干细胞学说认为：肿瘤组织中存在一小群细胞而非整个细胞群具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着重要作用，是肿瘤生长、转移和复发的根源, 这类细胞就是肿瘤干细胞。1997 年Bonnet在血液系统肿瘤中首先证实了肿瘤干细胞的存在。近年来，随着干细胞分化抗原的研究进步、细胞表面特异性标志的确定以及流式细胞仪的广泛应用，肿瘤干细胞的相关研究得到快速发展。CD133作为一种干细胞标记物在多种实体肿瘤，如肝癌、结肠癌、脑肿瘤、肺癌和前列腺癌及B16黑色素瘤等肿瘤中得到证实。大量研究发现，CD133阳性肿瘤细胞与肿瘤发生、侵袭、转移、耐药及复发有着密切的关系。而高速度、高纯度地分离带有某种特异性标志的细胞一直以来都是分选型流式细胞仪的优势所在，因此，利用流式高速分选仪将含量极低的CD133阳性细胞纯化并培养，成为肿瘤干细胞研究的一个重要手段。
CD133阴性对照
CD133+低阳性率分选
图5. 中山大学肿瘤防治中心人结肠癌CD133+细胞分选。CD133+细胞在样本群体中的比例极低，仅有0.049%，使用 BD FACSAria成功进行低阳性率细胞分选。
转GFP基因斑马鱼体细胞（百万分之一）
转基因动物不仅可以用来研究基因功能，也可按照人的志愿改良动物的遗传品质，为人类探讨疾病发病机理，寻求有效治疗途径，提供筛选和坚定药物的理想模型。
图6. 使用BD FACSAria采集及微量阳性率数据， 百万分之一的稀有样本检测及分选。
在科学研究中，我们见到的样本阳性率不总是那么高，有时甚至需要检测一些荧光信号很弱的自发荧光的样本并将其分选出来，所以高灵敏度和分辨率的仪器对于科学研究的重要性显而易见。
大鼠胰岛β-细胞分析分选 （自发荧光检测）
糖尿病的发病机制尚不完全清楚，但胰岛β- 细胞的功能障碍是公认发病的重要环节和决定性因素，因此对β- 细胞的研究十分重要。目前主要是利用活体、体外胰岛和β- 细胞株进行β- 细胞相关研究，但由于胰岛含多种细胞，即使将活体胰岛分离出来或体外胰岛都不能完成专门针对β- 细胞的研究，因此必须将β- 细胞从胰岛中分离纯化，并进行β- 细胞的原代培养。其中流式细胞术分选法是分离高纯度高活性β- 细胞非常有效可行的方法。
早在上世纪80年代D.G.Pipeleers等人即采用酶消化后，通过流式细胞仪检测β- 细胞光散射特性进行分选，离散的β- 细胞FAD荧光强度较非β- 细胞高3倍，且光散射强度较非β- 细胞高50%，分选纯化后的细胞悬液中β- 细胞纯度可高达90%以上(见图1)，且可以保证β- 细胞的活性，现在，β- 细胞分离纯化研究中流式细胞分选的应用已越来越为普遍，流式细胞分选法以其快速、有效、可靠已成为β- 细胞分离最为有效可行的方法之一。
图7. 流式细胞术分选大鼠胰岛细胞
实验结果：用BD FACSAria II成功在大鼠胰岛细胞中分选出含量约为31%的β- 细胞，从分选前后DAPI染色图谱可见，分选后细胞中有96%以上为发绿色荧光的β- 细胞，96%以上细胞为活细胞（蓝色），已培养用于后续实验，充分说明了BD FACSAria II分选纯度高，分选活性好，同时因此实验是利用β- 细胞中黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenosine dinucleotide，FAD）的高含量导致β- 细胞较其他胰岛细胞有更强的自发荧光，但这种自发荧光信号仍远弱于荧光染料的特异性荧光，故也从侧面说明BD FACSAria II检测灵敏度很高。
A.流式图谱
B.分选前后DAPI染色后荧光图片
图8 分选前后细胞的胰岛素染色，蓝色为DAPI（染细胞核），绿色为β- 细胞（FAD自发荧光）
相关文献:简介：这是西澳大利亚医学研究所（WAIMR）的糖尿病研究中心2009至2010年的研究报告中的一个报告，该报告主要研究了胰前体细胞向功能性胰岛Beta细胞的分化。研究人员使用了特定转基因鼠，这种转基因小鼠可使胰前体细胞呈绿色荧光，使表达胰岛素细胞呈红色荧光，使用BD FACSAria将小鼠胰前体细胞分选后放在特定的促分化培养基中继续培养，从荧光显微镜照片可见，从第一天到第四天，绿色的胰前体细胞逐渐分化成为红色的表达胰岛素β细胞，非常明显，而其中显现橘黄色的细胞是绿色和红色两种颜色的混和色，直接证明了胰岛素表达β细胞是培养基中的胰前体细胞分化而来（见下图）。此实验的成功更是直接证明了BD FACSAria分选细胞的高活性和高纯度。（Western Australian Institute for Medical Research(WAIMR) : Centre for Diabetes Research- Research Report for the Diabetes Research Foundation ( May 2009 to May 2010) Topic 1:
Differentiation of pancreatic progenitor cells into functional beta cells Dr Fang-Xu Jiang, Prof Grant Morahan）
编辑: gaowei2010
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