561nm 激光器检测PE家族染料的优势
研究背景:
561nm激光可激发的荧光素包括：PE、PE-Texas Red、PE-Cy5、PE-Cy7、RFP、mCherry等，它是PE和mCherry的最佳激发波长，因此用561nm激光器激发PE， 可极大提高PE、PE家族染料（见图1）及mCherry等红色荧光蛋白（见图2）的检测灵敏度和分辨率，从而发现一些过去不能被发现的低表达细胞群体和特殊表面标志物（见图3），同时，用561nm激光激发PE，可大大减小PE与FITC的光谱重叠（见图4），免除荧光补偿调节的同时提高检测灵敏度和分辨率；此外，同时，561nm激光器可以鉴定RFP转染效果以及追踪转染的细胞，并分选出感兴趣的细胞群；而基于mCherry的双分子荧光互补系统研究(BiFC)，更能够检测细胞内蛋白质之间的相互作用，具有简单,快速,直观,灵敏及定位等特点。
图9. 488nm激光(蓝)和561nm激光(绿)激发PE效果对比：散点图叠加图(左)，CD4 PE被激发Stain Index比较(右)
图10. 488nm激光(蓝)和561nm激光(绿)激发mCherry效果对比：散点图叠加图(左)，mCherry被激发Stain Index比较(右)
图11.摘自：Catherine Mclntyre.et.al ：Advantages of the 561-nm laser on the BD FACSAria III (April 2010)
实验案例:
某高校血液学研究中心主要进行血栓与止血、白血病及其它造血系统疾病的临床与基础研究、造血干细胞生物学及应用造血干祖细胞的细胞/基因治疗三大研究，创办至今短短两年时间，就在Nature、PNAS、Blood 等国际顶级杂志上发表数篇文章，科研实力雄厚。该中心与2011年底购置了BD FACSAria III，配备561nm 激光器，值得一提的是，该中心还拥有一台 MoFlo XDP，但FACSAria III 装机后，所有分选实验均改由FACSAria III 来完成。
本实验为小鼠骨髓细胞三色标记后分选造血干细胞，561nm激光激发PE，488nm激光激发FITC，633nm激光激发APC。
结果讨论:
检测灵敏度是一台流式细胞仪中最为重要的性能参数之一，检测灵敏度越高，弱阳性样本检出率就越高，阴阳性群体的区分度就越大，对于同一样本，影响检测灵敏度的因素有很多，包括仪器本身的设计以及荧光染料被激发的效率等。BD FACSAria III因其独特创新的仪器设计，是全球目前检测灵敏度最高的高速流式细胞分选仪，其灵敏度高达: FITC<85MESF,PE<29MESF，比竞争对手同类产品高出2倍有余（FITC<150MESF,PE<100MESF）；同时FACSAria III创新的X6激光平台实现同时可安装6根激光器，可选的激光器中加入了独特应用的激光器，包括561nm激光器。561nm其实是PE及PE家族的最佳激发波长，因此用561nm激光激发PE及PE家族的激发效率要比488nm激光激发的效率高很多，激发效率高意味着荧光染料被激发得更亮，检测灵敏度相应也就更高了。
在本案例中，用BD FACSAria III检测造血干细胞，488nm激光检测FITC信号，633nm激光检测APC信号，561nm激光检测PE信号。用了561nm激光后，从FITC、PE单阳管流式图（图12）可见，FITC与PE之间不需要做荧光补偿；更重要的是，用了561nm激光后，可以看到在MoFlo XDP上看不到的一群细胞（图13），强有力的证明了FACSAria III的检测灵敏度和分辨率大大优于MoFlo XDP，更加适合弱表达细胞群体的区分，充分体现了561nm激光在激发PE家族染料上的绝对优势。
相关文献:
简介: 这是BD Biosciences所做的一篇Application Note，主要针对FACSAria III上的561-nm黄绿激光做了很多与488nm蓝激光的对比试验，证明了561nm黄绿激光在激发PE、PE家族染料以及红色荧光蛋白（如: mCherry）方面的高灵敏度，用561nm激光极大的提高了弱阳性群体的检出率；同时也阐述了用561nm激光激发PE、488nm激光激发FITC，两者间的荧光光谱重叠比488nm激光同时激发FITC和PE的光谱重叠要少得多，基本可以实现无需补偿，更加提高了检测灵敏度。（Advantages of the 561-nm (Yellow-Green) Laser on the BD FACSAria III
Catherine McIntyre, Gil Reinin, Dennis Sasaki, BD Biosciences. Application Note. April 2010）
编辑: gaowei2010
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